血清学实验指导汇编Word格式文档下载.docx
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猪瘟病毒ELISA抗体检测技术
实验一0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液的制备
一、目的要求
掌握磷酸盐缓冲液的制备方法,为后续的血清学检测奠定基础。
二、药械及耗材
电子天平,小电炉,药匙,1000ml烧杯,玻棒,500ml三角瓶(带棉塞),pH试纸;
Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、NaCl、蒸馏水;
1NNaOH、1NHCl(滴管瓶塞)。
三、试验程序
配方:
Na2HPO4.12H2O2.9克
KH2PO40.3克
NaCl8.0克
蒸馏水1000ml
将上述成分称量在烧杯中,加热搅拌溶解,待完全溶解以后,调整pH值至7.4。
然后分装在3个三角瓶中(每瓶大约330ml),加棉塞,橡皮筋捆扎,置高压灭菌器中121℃15min灭菌处理,备用。
实验二1%鸡红血球悬液的制备
掌握鸡红血球悬液的制备方法,为后续的血凝和血凝抑制试验奠定基础。
二、药械与耗材
公鸡,玻璃注射器(30ml),16#大针头,5%柠檬酸钠;
800型离心机,玻璃离心管(10ml),洗耳球,10ml移液管,2ml移液管,棉花;
0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液。
※从心脏采集公鸡的抗凝血约25ml,平均分装3支离心管;
※作对称平衡以后,3000rpm离心10min,弃上清液,保留红血球泥;
※加入适量PBS,用乳头滴管轻轻地洗涤红血球,然后作对称平衡,3000rpm离心10min,弃上清液,保留红血球泥;
※重复上述操作2~3次,直至上清液清亮透明;
※用10ml移液管轻轻地吸去上清液弃之,保留红血球泥;
※用10ml移液管向三角瓶中加入49.5mlPBS,再用2ml移液管吸取0.5ml红血球泥,棉花擦去移液管外壁粘附的红血球。
将0.5ml红血球泥放入49.5mlPBS中,混匀置于4℃冰箱备用。
实验三禽流感血凝(HA)试验
流感病毒颗粒表面的血凝素(HA)蛋白,具有识别并吸附于红细胞表面受体结构,HA试验由此得名。
本试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。
可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定,也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。
磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50μL移液枪、25μL移液枪、微量振荡器。
1%鸡红细胞悬液制备,参照实验二。
三、诊断试剂和待检样本
禽流感病毒血凝素分型抗原。
四、试验程序
※在微量反应板的1~12孔均加入25μLPBS,换滴头。
※吸取25μL病毒悬液加入第1孔,混匀。
※从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔,混匀后吸取25μL加入第3孔,如此进行对倍稀释至第11孔,从第11孔吸取25μL弃去,换滴头。
※每孔再加入25μLPBS。
※每孔均加入25μL1%鸡细胞悬液(注:
勿必将红细胞悬液摇匀)。
※振荡混匀,在室温(20~25℃)下静置40分钟后观察结果(如果环境温度太高,可置4℃环境下)。
对照孔红细胞将成为明显的钮扣状沉到孔底。
结果判定:
将板倾斜,观察红细胞有无呈泪滴状流淌。
完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。
以使红细胞100%凝集的抗原最高稀释倍数作为血凝效价。
实验四禽流感血凝抑制(HI)试验
流感病毒颗粒表面的血凝素(HA)蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。
磷酸盐缓冲液、3.8%柠檬酸盐溶液、96孔V型血凝板、50ul移液枪、25ul移液枪、微量振荡器。
禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。
根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。
以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点,终点稀释倍数除以4,即为含4HAU的抗原的稀释倍数。
例如,如果血凝的终点滴度为1:
256,则4HAU抗原的稀释倍数应是1:
64(256/4)。
※在微量反应板的1~11孔加入25ulPBS,第12孔加入50μLPBS。
※吸取25ul血清加入第1孔内,充分混匀后吸25μL于第2孔,依次倍比稀释至第10孔,从第10孔吸取25μL弃去。
※1~11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25μL,室温静置至少30分钟。
※每孔加入25μL1%鸡红细胞悬液混匀,轻轻混匀,静置约40分钟,对照红细胞将呈钮扣状沉于孔底。
以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。
只有阴性对照孔血清滴度不大于22,阳性对照孔血清误差不超过1个滴度,试验结果才有效。
HI价小于或等于判定HI试验阴性;
HI价等于23为可疑需重复试验;
HI价大于或等于24为阳性。
实验五口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验
(NSP3ABC-I-ELISA)
口蹄疫(FMD)是一种高度接触性传染病,传播迅速,可形成世界性大流行,对养殖业和国际畜产品贸易具有严重的负面影响。
控制和消灭FMD策略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群在采用疫苗的国家,大多数动物血清口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白和病毒相关抗原(VIAA,即3D)抗体均为阳性。
因此,一些基于结构蛋白和VIAA的诊断方法很难确定口蹄疫病毒感染与否。
只有将感染动物和隐性带毒动物与疫苗免疫动物加以区分,才能为FMD的控制和消灭提供科学的依据。
目前的疫苗生产工艺,在病毒纯化过程中去除绝大部分非结构蛋白,因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3BC抗体产生,而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体,也有非结构蛋白3ABC抗体。
因此检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物,而且可以区分感染动物和免疫动物。
本试验采用FMDNSP3ABC-I-ELISA试剂盒检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体。
用于活畜进口调运、疫区净化检疫和群体无症状感染评价,区分感染和免疫动物。
2ml指弹头离心管,吸水纸,1~10ul移液枪,10~100ul移液枪,500ul移液枪,250ml烧杯,液体稀释槽,小、中、大移液枪尖。
3ABC-I-ELISA诊断试剂盒、待检血清样本。
※将试剂盒配备的25倍浓缩PBST用无离子水或蒸馏水做1:
25倍稀释待用。
※待检血清样品和阳性、阴性对照血清用血清稀释液1:
21倍稀释(120ul血清稀释液加血清6ul),每孔加入100ul,阴、阳性对照血清样品平行加两孔,用封口膜封口,37℃结合30分钟。
※取掉封口膜,每孔加满洗涤液,洗涤5次,最后一次拍干。
※用血清稀释液按1:
100比例稀释酶标二抗,每孔加入100ul,用封口膜封口,37℃结合30分钟。
※每孔加入50ul底物溶液B(H2O2)和50ul底物溶液A(TMB)混匀。
封口膜封口,37℃避光作用10-15分钟。
※每孔加入100ul终止液(H2SO4)。
※轻轻摇振混匀,测定波长450nm吸光值。
阳性对照平均OD值应大于0.6;
阴性对照应小于0.2。
结果计算:
样品效价为:
(OD样品-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)。
若效价<
0.2,为阴性;
效价在0.2~0.3之间为可疑;
效价>
0.3为阳性。
可疑样品进行复测,仍为可疑判为阳性。
五、试验安排与结果
设一套阴、阳性对照。
判定样品效价。
图96孔酶标板布局图
A
B
C
D
E
F
G
H
123456789101112
阴性
阳性
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