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1.3主要仪器设备及耗材
(1)瑞士TecanSunrise酶标仪:
早稻田(北京)生物科技发展有限公司上海办生产。
(2)洗板机:
(3)高精度加样器及枪头:
0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
(4)37°
C恒温箱
(5)BNⅡ免疫特种蛋白分析仪:
上海SIEMENS公司生产。
(6)日立7600全自动生化分析仪:
北京九强生物技术有限公司生产。
1.4试验方法
1.4.1ELISA法测血清抵抗素含量
从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4°
C。
分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
将浓度依次为0ng/ml,3ng/ml,6ng/ml,12ng/ml,24ng/ml,48ng/ml,的标准品50ul分别加入标准孔,将待测血清10ul分别加入待测样品孔,再加样品稀释液40ul,空白孔不加。
除空白孔外,标准品和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100ul,用封板膜封住反应孔,,37°
C恒温箱温浴60分钟。
弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上排干,如此重复洗板5次。
依序每孔加入底物A、B各50ml,37°
C避光孵育15min。
依序每孔加终止溶液50μl,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
在加终止液后15分钟以内进行检测。
1.5高灵敏度的动态散射免疫比浊原理检测尿微量白蛋白
使用SIEMENS公司BNⅡ免疫特种蛋白分析仪分析测定,试剂采用上海SIMENS医学诊断产品有限公司液体试剂,质控品、定标品均由西门子公司提供,检测方法:
散射免疫比浊法。
1.6乳胶颗粒增强免疫比浊法血清胱抑素C测定
采用日立7600全自动生化分析仪分析测定,试剂采用北京九强生物技术有限公司双液体试剂,质控品,校准品由该公司提供。
检测方法:
乳胶颗粒增强免疫比浊法。
1.5统计学处理
采用SPSS17.0统计学软件进行分析,计量资料数据以x±
s表示,两组比较分析采用t检验;
P<
0.05为差异有统计学意义。
阳性率比较用……….
二、结果
2.1血清抵抗素的检测结果
酶标仪分析得出的标准曲线见图1,糖尿病肾功能正常组(M1)与糖尿病肾功能早期损害组(M2)的血清抵抗素含量差异有显著统计学意义(P<
0.01,见表1)。
三组血清抵抗素含量平均值的直观分布图见图2。
2.2糖尿病肾病早期诊断指标阳性率比较离群值?
健康者(M3)的血清抵抗素含量为27.1±
6.5,包含95%健康者(M3)的范围视为本次试验血清抵抗素含量的正常值范围。
下限是14.36,上限是40.63。
各组研究对象的血清抵抗素含量与正常值范围比较,高于上限值为阳性结果。
经计算,血清抵抗素阳性率为67.7%。
又测得糖尿病肾功能早期损害组尿微量白蛋白阳性率为73.9%,血清胱抑素C阳性率60.9%。
因此,肾脏功能早期损害的诊断指标阳性率由高到低依次为:
尿微量白蛋白、血清抵抗素、血清胱抑素C。
图1:
经过酶标仪分析得标准曲线
表1:
各组抵抗素含量测定结果(n=89,x±
s)
组别
例数
血清抵抗素
(ng/ml)
糖尿病肾功能正常组(M1)
33
34.4±
8.64
糖尿病肾脏早期损害组(M2)
31
43.57±
8.47
健康对照组(M3)
25
27.1±
6.5
注:
?
与M1组比较,P<
0.01
图2:
各组抵抗素含量测定
三、讨论
抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的多肽类激素,有研究显示抵抗素是一种与肥胖、糖尿病有关的重要激素,其作用是对抗胰岛素,促使血糖水平升高、脂肪细胞增生而导致肥胖。
新近研究显示,抵抗素主要表达在单核细胞上,能增加其他致炎因子和粘附因子的表达,是一种炎性细胞因子[13-15]。
有研究显示循环中的抵抗素水平与炎症标记物相关,而低度的炎症反应在慢性肾脏病的进展中起到一定作用。
抵抗素可增加内皮素、粘附分子、和他内皮活性物质和炎症介质的表达。
这些通过抵抗素诱导的体液性介质可促进全身性血管功能紊乱,进而影响肾小球滤过率和尿蛋白排泄率[2-4]。
糖尿病肾病,是影响糖尿病患者生活质量及寿命且耗资巨大的严重微血管并发症之一。
是糖尿病最常见和最早期的并发症,在发达国家已成为终末期肾病的首要原因。
在我国糖尿病性肾病已占糖尿病患者总数的15%左右,且以每年8%-10%速率递增[16,17]。
已成为导致慢性肾衰竭的第3位疾病,接受透析治疗的终末期肾病患者15%,是由糖尿病肾病所致。
糖尿病肾病的发生与发展和其他慢性并发症一样,是多种因素综合作用所致。
多研究表明,在糖尿病肾病的发生、发展中,炎性反应起着重要的作用。
有研究表明糖尿病患者血清抵抗素水平与血管内皮功能紊乱相关。
Verma等及Kawanami等在体外实验发现,人抵抗素可促使血管内皮细胞表达细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、分泌单核细胞趋化蛋白-1,促进内皮素-1分泌,提示抵抗素可作用于血管内皮细胞,导致其功能紊乱[5,6]。
糖尿病肾病早期肾脏病理改变大多是可逆的,因此及早预防和诊治是至关重要的。
以往,我们常用微量白蛋白、血清胱抑素C、NAG等作为糖尿病肾病早期诊断的常用指标,但是尿微量白蛋白缺乏特异性。
血清胱抑素C特异性和灵敏性较差。
而NAG在服用某些药物(如氨基糖甙类抗生素、镇痛剂)或合并感染时尿NAG也会增高。
目前临床常将MA/Cre作为糖尿病肾脏早期损害的监测指标。
虽然其稳定性好,测量不受时间限制,对糖尿病患者肾脏损害有早期诊断价值,但此检测方法一般需要检测连续三天患者的晨尿中微量白蛋白与尿肌酐的含量,既增加了患者的经济负担又使门诊患者不易做到以上要求,使得患者错过了早期诊治的时机,给患者造成了巨大的生理和精神痛苦,加重了社会经济负担。
而早期肾小球微穿刺又因为操作复杂、过程痛苦等原因不易被患者接受。
因此,寻找一种能够比较灵敏地反映早期肾功能改变的诊断指标迫在眉睫。
本实验发现,糖尿病肾早期损害患者血清抵抗素含量明显高于糖尿病肾功能正常患者(P<
0.01,见表1),这说明随着糖尿病肾功能损害程度的发展,血清抵抗素水平逐渐增高。
抵抗素可能作用于血管内皮细胞,导致其功能紊乱并参与2型糖尿病肾病微血管并发症的形成与恶化。
因此可尝试通过降低抵抗素水平减轻血管内皮功能紊乱来保护肾组织,从而阻止或延缓糖尿病肾病的发展。
微量白蛋白在M2组的阳性率为73.9%,高于血清胱抑素C阳性率和血清抵抗素阳性率。
尿微量白蛋白是肾脏早期血管功能受损的标志,其阳性率高,即能预测真正患病的正确率高(结果不稳定)。
血清抵抗素在M2组的阳性率为67.7%,其在糖尿病肾功能早期损害患者中预测真正患病的百分数低于尿微量白蛋白但高于血清胱抑素C。
虽然血清抵抗素在M2组阳性率低于尿微量白蛋白阳性率,但是血清抵抗素含量测定能克服尿MA特异性低,门诊患者不易多次检测求证等弊端。
因此,血清抵抗素和尿微量白蛋白联合检测对糖尿病肾脏早期损害具有积极的诊断价值。
文中没有证实
因为本次试验人抵抗素ELISA检测试剂盒微孔酶标板96孔配置有限,约三分之二微孔用于检测M1组和M2组血清抵抗素含量,因此健康对照者数量有限,可能会对正常参考值范围有一定影响。
今后待补充健康对照者血清抵抗素含量,完善试验结果。
四、结论
1.随着肾功能损害程度加深血清抵抗素水平逐渐增高。
2.糖尿病肾早期损害患者的血清抵抗素水平明显高于糖尿病肾功能正常者,经统计学分析有显著性差异(P<
0.01),可以做为糖尿病肾功早期损害的诊断依据。
3.血清抵抗素含量测定的阳性率由高到低依次为:
血清抵抗素与尿微量白蛋白联合检测对糖尿病肾脏早期损害具有积极地诊断价值。
此话有问题
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抵抗素测定在糖尿病肾病早期诊断中的价值探讨的研究进展
李丝冰综述张翠玲审校
糖尿病是常见多发的慢性代谢性疾病,据流行病学调查,目前我国约有3000多万糖尿病患者。
糖尿病人后期可出现各种慢性并发症——慢性肾功能衰竭、失明、心脑血管病,它们严重危害人的身体健康乃至生命[1]。
其中糖尿病肾病是最常见最早期的慢性并发症。
美国肾脏病数据统计资料显示,糖尿病肾病为终末期肾病的首要病因[2]。
1998年,欧洲肾透析移植学会统计资料表明,终末期肾病病因约为28%是糖尿病肾病。
在我国,据资料表明,糖尿病肾病的发病率在国内占糖尿病的0.9%-36%。
其早期肾脏病理改变大多是可逆的,但终末期糖尿病肾病的5年生存率小于20%。
糖尿病肾病以每年约10%速率递增,已占终末期肾病患者总数的15%左右。
因此及早预防及诊治糖尿病肾病至关重要[3]。
糖尿病肾病是指在糖代谢异常多年后,以血管损害为主的肾小球病变[2]。
糖尿病肾病的发生是多种因素综合作用所致。
许多研究表明,在糖尿病肾病的发生、发展中,炎性反应起着重要的作用。
因为糖尿病肾病发病率逐年递增,已成为糖尿病主要的死亡原因,使得糖尿病肾病作为一种世界范围内值得重点防治的疾病引起人们的广泛关注,所以寻找一种灵敏的反映糖尿病早期肾脏损害的指标尤为重要。
一、糖尿病肾病的自然进程
糖尿病肾病的定义为持续的白蛋白尿[尿白蛋白排泄率(UAER)>
300mg/d]、肾小球滤过率下降和血压升高。
一旦发生显性肾病,若未予干预,肾小球滤过率在数年内将逐渐下降,下降速度因人而异(2-20ml/min/year)[4]。
Mogensen将糖尿病肾病的演进分为5个阶段1.第1期以肾小球的高滤过和肥大为特征。
2.第2期有肾小球细膜扩张和基膜增厚。
3.第3期可检出微量白蛋白尿(20-200ug/min)伴血压从基础水平升高。
4.第4期出现临床蛋白尿(200ug/min)和高血压。
5.第5期为ESRD.健康人的平均UAER是5ug/min,且很少超过15ug/min,UAER在20-200ug/min(30-300mg/d)时定义为微量白蛋白尿,这与20-200mg/l的水平是一致的[1]。
肾病的最初几年,其特征是持续加重的微量白蛋白尿(UAER为30-300mg/d或20-200ug/min),这时只有通过特殊的检测方法才能检测到。
肾小球内压力增高是肾病初期的主要病理改变。
微量白蛋白尿是糖尿病肾病早期诊断的敏感指标。
微量白蛋白尿预示了2型糖尿病患者肾病的发展。
在对糖尿病患者4年的研究中,持续微量白蛋白尿出现后,白蛋白排泄率以15%-40%的速度持续增加[3]。
2型糖尿病肾病患者中,有很高比例的患者在诊断为糖尿病同时,就已经存在微量或显著蛋白尿,这主要是因为在做出诊断之前,患糖尿病往往已经有数年的病史了[1]。
二、抵抗素的研究现状
脂肪细胞可分泌瘦素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、脂联素等物质,调节机体的能量代谢,在胰岛素抵抗发生过程中发挥重要作用。
肥胖与2型糖尿病高度相关,但是联系肥胖和糖尿病的确切分子机制仍不十分分明了。
Mogensen在研究抗糖尿病药物——噻唑烷二酮类药物时,发现脂肪细胞可分泌一种肽类激素分子——抵抗素,引起了人们的广泛注意。
它是一种富含半胱氨酸的蛋白质,定位于染色体19p13.3,属于抵抗素样分子家族(RELMs)[4]。
1RELMa家族
RELMs家族(人和大鼠)都富含Cys。
是由105-114个氨基酸组成的蛋白质,包括RELM-α/FIZZ1和RELM-β/FIZZ3、抵抗素、FIZZ3。
RELM-α以单体形式分泌,其mRNA可在脂肪组织、舌、肺脏、乳腺等组织检测到,在炎症反应过程中也有表达[4],但不在3T3-L1脂肪细胞中表达;
RELM-β是一种肠源性的分泌激素,在小鼠的胃肠道特别是结肠含量丰富,在增生的上皮细胞基因表达最多,尤其在发生肿瘤是明显的增高;
抵抗素(Resistin)是由白色脂肪组织特异性分泌的一种促胰岛素抵抗的信号分子,约由114个氨基酸组成,分子量约为12.5KD[5]。
2临床研究
抵抗素在肥胖非糖尿病患者腹部大网膜脂肪组织的含量与腹部皮下相似,均明显高于大腿脂肪组织。
腹部脂肪组织抵抗素的表达上升,可能与腹型肥胖增加患T2DM的危险有关[4]。
虽然有学者对于抵抗素是联系肥胖和2型糖尿病的危险因子提出质疑,但是不同的试验室测定方法可能造成抵抗素水平的差异,并且在不同部位脂肪以及种族之间,抵抗素对于胰岛素敏感性的影响有一定的差异。
因此有关抵抗素的生物学特性、调节因素以及它在IR形成过程中的机制将成为今后研究的热点,它的发现对于肥胖症和糖尿病的防治具有重要意义。
三、2型糖尿病肾病与血浆抵抗素的关系
抵抗素是一种由脂肪细胞分泌的多肽类激素,是RSTN基因编码的产物。
抵抗素能拮抗胰岛素,促使血糖升高并导致脂肪细胞增生[6]。
近年来人们认为DM存在严重的系统性炎性反应,进而抵抗素可能通过损害或抑制月细胞的胰岛素分泌功能,导致血糖升高[2]。
新近研究显示人类的抵抗素主要表达在单核细胞上,是一种炎性细胞因子。
抵抗素能诱导炎性液体介质如细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1等分泌,因此它与血管疾病相关的内皮功能受损关系可能更为密切。
糖尿病肾病是指在糖代谢异常多年后,以血管损害为主的肾小球病变。
多种因素综合作用导致早期糖尿病肾病发生[15]。
据资料显示,炎性反应在DN的发生、发展中起着举足轻重的作用。
现已证实内皮功能紊乱参与了2型糖尿病微血管病变的发生。
因此抵抗素可能参与了2型糖尿病的形成、与血糖控制不良程度相关并进一步参与糖尿病肾病微血管并发症的发展与恶化[7]。
体外实验还发现,在单核细胞分化为巨噬细胞表型时,抵抗素的mRNA水平较分化前增加了4倍,这同样证实了抵抗素与单核巨噬细胞的功能有重要相关性的结论[12]。
四、抵抗素对糖尿病肾病早期诊断的价值探讨对临床的意义
以往,对糖尿病肾病早期诊断的常用诊断指标:
1尿微量白蛋白(mAlb);
尿中微量蛋白有助于早期DN的诊断,但缺乏特异性[7]。
2血清胱抑素C;
可作为肾小球滤过功能指标,其优点是不受炎症反应、性别、肌肉含量以及年龄变化等的影响,但特异性和灵敏性较差[8]。
3血清高敏c反应蛋白;
通过影响内皮功能使微血管病变,加速动脉硬化进展,因此血清高敏C反应蛋白作为一种炎症指标在早期糖尿病肾病患者诊断中具有重要参考价值,其缺点是特异性和灵敏性不高[10]。
4N一乙酰一B一氨基葡萄糖苷酶(NAG);
在肾脏近端肾小管上皮细胞中含量特别丰厚,,在肾小管损伤时由肾小管上皮细胞释出,是反映肾小管损害的指标之一,其缺点是服用某些药物(如氨基糖甙类抗生素、镇痛剂)或合并感染时尿NAG也会增高[11]。
5MA/Cre;
其优点是结果稳定性较好,测定不受时间限制,对糖尿病患者肾脏损害有早期诊断价值,但此检测方法一般需要检测连续三天患者的晨尿中微量白蛋白与尿肌酐的含量,既增加了患者的经济负担又使门诊患者不易做到以上要求,可能造成漏诊而延误病情[12]。
以上各指标都有其优缺点,对糖尿病肾病的诊断不是很理想,而早期肾小球微穿刺又因为操作复杂、过程痛苦等原因不易被患者所接受[13]。
现行临床应用较多的微量白蛋白与尿肌酐的含量比既费时又费力,这往往使得患者错过了早期诊治的时机,给患者造成了巨大的生理和精神痛苦,加重了社会经济负担。
[14]因此,寻找一种灵敏高特异性强的诊断方法迫在眉睫。
通过本研究可以进一步探讨抵抗素在糖尿病肾病早期诊断中的价值,从而为临床提供更科学更精确更快捷的实验室指标。
因此,我们对抵抗素在糖尿病肾病早期诊断中的作用进行研究为找到糖尿病肾病早期诊断的最佳诊断依据迈出至关重要的一步。
五、抵抗素测定在糖尿病肾病早期诊断中的价值展望
尽管现阶段大量临床和实验证据都证明抵抗素对糖尿病肾病早期肾脏微血管受损的炎症反应有十分重要的调控作用,但是人们对这种作用的分子机制的了解甚少,抵抗素对糖尿病肾病肾脏微血管的炎性反应受体还未找到,使其研究受到很大限制。
抵抗素在炎症反应中的具体作用,它与各种炎症因子相互作用的原理,其作用的实现途径等,这些问题还需要进一步的探讨研究。
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