基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文Word格式文档下载.docx

基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文Word格式文档下载.docx

《基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文Word格式文档下载.docx（34页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

WuChongde

Abstract

Keratinase,specializedindegradationofkeratin,isusedextensivelyinthetreatmentofwastefeatherandthetechnologyofcleanproductioninleatherindustry.Thismanuscriptaimedtoscreenhighkeratinase-producingstrainthroughgenomeshufflingbyusingBacilluslicheniformisX-47asparentalstrain.Theconditionsforgenomeshufflingwereoptimized.theoptimalcellagewas9h,andtheoptimallysozymeconcentration,enzymatictime,andtemperaturewere1.0mg/mL,30min,and40℃,respectively.Thefusiontime,fusiontemperature,pH,andPEFconcentrationwere15min,35℃,pH9.0and400g/mL,respectively.Undertheoptimalconditions,thefirstgenerationoffusantsY1-28andY1-31werescreened,andthekeratinaseactivitieswere240.9±

7.2U/mLand257.5±

17.5U/mL,whichincreased68.4%,and80.0%,respectively,comparedtotheparentalstrain.ThesecondgenerationoffusantY2-33wasisolatedbyusingY1-28andY1-31aspartentalstrains.TheactivityofY2-33was318.2±

31.2U/mlwhichincreased122.4%comparedwiththeoriginalstrain.

Keywords：

GenomeshufflingKeratinaseBacilluslicheniformis

目录

第一章前言1

1.1角蛋白酶概述1

1.1.1角蛋白及其利用1

1.1.2角蛋白酶的研究1

1.2基因重排技术（Genomeshuffling）2

1.2.1基因组重排技术原理2

1.2.2基因组重排技术方法2

1.2.3基因组重排技术的优点3

1.3本论文研究的目的意义、思路设计及主要内容4

1.3.1研究目的意义4

1.3.2论文设计思路4

1.3.3主要内容5

第二章材料与方法6

2.1实验材料6

2.1.1菌种6

2.1.2药品与试剂6

2.1.3培养基7

2.1.4主要仪器设备7

2.2实验方法7

2.2.1角蛋白酶活力分析方法7

2.2.2原生质体的制备和再生8

2.2.3原生质体的灭活8

2.2.4原生质体的融合及其条件优化8

2.2.5融合子的检出9

第三章结果与讨论10

3.1最适菌龄的确定10

3.2酶解最佳条件的确定10

3.2.1溶菌酶最佳浓度的确定11

3.2.2最佳酶解时间的确定12

3.2.3最佳酶解温度的确定12

3.3酶解后原生质体形成率、再生率和灭活率13

3.4原生质体融合条件的优化14

3.4.1原生质体融合最佳温度的确定14

3.4.2原生质体融合最佳作用时间的确定15

3.4.3原生质体融合最佳PEG浓度的确定16

3.4.4原生质体融合最佳pH的确定17

3.5B.licheniformisX-47的基因组重排17

3.5.1第一轮基因组重排17

3.5.2第二轮基因组重排18

结论20

参考文献21

附录1Lowry法测定蛋白质含量24

声明25

致谢26

第一章前言

1.1角蛋白酶概述

1.1.1角蛋白及其利用

角蛋白是自然界中最丰富的蛋白质之一，人的毛发，动物的羽毛、爪子等都存在大量角蛋白[1]。

角蛋白由于其构型的不同，我们把它分为α和β两个类型的角蛋白，人类和动物的毛发就是主要由α-角蛋白构成。

β-角蛋白多见于羽毛中，来自α-角蛋白的可逆转变，以氢键连接而堆叠成多层结构组织。

因角蛋白含硫量的不同，故又把它分为硬角蛋白和软角蛋白。

硬角蛋白也被称为真角蛋白，它拥有含脂类少、结构牢固、含硫量高、组织紧密等特点；

而软角蛋白又被称为假角蛋白，它的含硫量不超过3%，脂类较多，组织结构柔软而疏松，不耐热，但其伸缩性比硬角蛋白要好[2-4]。

高度交联的胱氨酸残基二硫键、氢键以及分子间疏水的相互作用使得角蛋白化学性质稳定，机械强度高，导致角蛋白难以被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等我们常见的一般蛋白酶所水解[5]。

角蛋白不能被畜禽直接吸收利用，必须经过高温、高压处理或者酸、碱、酶作用，变成短肽或游离氨基酸，才可以被畜禽利用。

羽毛是家禽经过一定处理后废弃的产物，每年废弃羽毛的数量相当巨大，全球达到了几百万吨。

作为角蛋白的主要来源，羽毛拥有极高的蛋白质含量，在作为优质蛋白质使用上具有巨大潜力[6-7]。

同时，羽毛角蛋白还可以作为优质的饲料或者饲料添加剂[8-9]。

角蛋白的应用十分广泛，它还可以用于生产氨基酸微量元素鳌合剂,与微量金属离子反应，生成稳定安全的环形结构化合物，从而可以提高微量元素的利用率。

反应生成的鳌合物易于吸收利用，能够有效改善动物体内的生理机能[10]。

由于全球鸡养殖的数量巨大，基于简单的生产工艺，使得鸡羽毛制复合型氨基酸铁成本低廉，有助于推广[11]。

1.1.2角蛋白酶的研究

Nickerson等[12]在1963年第一次提出了拥有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。

角蛋白酶能够特异性降解角蛋白，将角蛋白水解成较短的肽链或者游离的氨基酸。

自然界中能够分泌角蛋白酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌等。

角蛋白酶是一种诱导酶，需要羊毛等角蛋白外部诱导才能生成。

Wawrzkiewica等[13]发现羽毛角蛋白可诱导Trichophytongallinae的角蛋白酶的表达。

再比如链霉菌分泌的角蛋白酶，如果没有诱导物进行培养，角蛋白酶产量只有原来的1/5.71[14]。

微生物分泌的角蛋白既有胞内酶又有胞外酶，但大多数分泌胞外酶，然而霉菌却会既分泌胞外酶又分泌胞内酶。

因角蛋白来源的不同，使得酶拥有不同的特性,以及其适宜底物也各不相同,部分角蛋白酶水解能力较强，能水解多数蛋白质,而有些则只能水解角蛋白,不能酶解胰蛋白、牛血清白蛋白等[15-16]。

已报道的多数角蛋白酶最适反应温度主要集中在30℃-75℃之间，多数为45℃-55℃，也有极少数的最适温度可以高达100℃，如Fervidobacteriumislandicum分泌的角蛋白酶[17-18]。

角蛋白酶的最适pH在酸性、中性和碱性均有分布，在4~13[19]之间，主要集中在7到10之间。

角蛋白酶一般有着比较广泛底物范围，包括多种可溶性和不溶性蛋白质，如牛血清蛋白、酪蛋白、胶原蛋白和卵蛋白等[20-21]，一种角蛋白酶仅对单一底物有较高的降解能力[22]。

1.2基因重排技术（Genomeshuffling）

1.2.1基因组重排技术原理

基因组重排（Genomeshuffling）技术在近几年飞速发展起来，是一种极其高效的微生物育种方法。

菌株诱变改良，再杂交育种，让不同的突变菌株的基因组能够充分重组，增加不同正向突变整合到一个重组子中的机会，从而大幅度提高了正变率，得到我们想要的表现型[23-24]。

基因重排技术被Stephanopoulos认为是菌种选育上的里程碑[25]。

亲本基因库在多位置发生交换和重组，大大的促进了正突变融合子的产生[26]。

1.2.2基因组重排技术方法

Zhang等[27]于2002年在Nature上首次提出将基因重组技术结合传统育种技术，通过多亲本基因重组交换，得到优良表型。

基因组重排技术是一种新型的育种技术，它是建立在原生质体融合技术之上的，让不同基因组重排的过程[28]。

基因组重排技术主要有三个步骤：

1）亲本基因库的建立；

2）原生质体递归融合；

3）融合子的筛选。

1.2.2.1亲本基因库的建立

建立亲本基因库是基因重组技术的基础，以原始菌株为基础，通过不同手段得到更多基因型，收集目的性状的菌株，从而形成所需的亲本基因库。

亲本菌株的筛选一般是菌株必须具备理想目的表型，如耐高温、高产或高生长率等。

亲本基因库的建立主要还是通过经典育种方法，诱变育种和直接筛选。

采用组合的经典育种方法能够保证基因库的多样性，很大程度上丰富亲本基因组库。

1.2.2.2原生质体递归融合

原生质体融合技术是基因组重拍技术的基础。

随着科技的发展，细胞基因重组的手段有很多，然而原生质体融合因为具有高频率的基因转移和重组效率被广泛使用。

但是多亲本的融合仍会发生较低的重组效率[27]，这个问题现在通过原生质体递归融合得到有效的解决。

多轮递归融合确保了基因的高转移频率，基因组重排的高效性也得到了保持。

原生质体的制备是递归融合的首要过程。

不同微生物的细胞壁结构会有很大差别，随意在原生质体的制备中，主要需要考虑到菌株的最适菌龄、最佳酶解浓度、最佳酶解时间、最佳温度的选择，以及再生培养基的设计等。

原生质体融合技术应用得最广泛的主要是化学助融和电处理融合法[29]。

然而随着科技的不断发展，越来越多的新技术产生，提高了原生质体融合的制备率和再生率。

红发夫酵母使用激光诱导融合来提高融合率[30]，微流体芯片技术也被用作诱导细胞融合[31]，镭射光镊子也作为一种新新技术被应用于细胞工程[32]。

图1-1原生质体融合过程示意图

Fig.1-1Theprocessofprotoplastfusion

1.2.2.3融合子的筛选

融合子的筛选是整个基因组重排过程中最为关键的步骤。

传统的菌株工程把基因多样性的产生和目的形状的筛选作为中心内容，基因多样性的方法已经有一些深入的研究，然而目的形状筛选方法仍然有待发展。

对于融合子的筛选，目前主要还是采用对目的菌产物的物理和化学性质分析判定。

如John等[33]利用能直接水解淀粉的乳酸融合菌在培养基上产生的透明圈的大小来筛选高产融合菌。

近年来，灭活标记、抗药性标记、光谱学标记和其他标记等方法也被应用于融合子的筛选，为基因组重排技术提供了一个新的方向。

1.2.3基因组重排技术的优点

基因组重排技术，与经典育种相比，有其独特优势。

（1）相比传统诱变选育更快更高效。

传统诱变育种通常把每一轮的突变体中筛选出的最优的一株菌作为下一轮诱变的出发菌株，而基因组重排技术则是将一次诱变获得许多正突变菌株共同作为亲本菌株，经过递归多轮融合实现大范围内的基因重组，以更高更快的效率获得目的菌[34]。

（2）能提高子代菌株的遗传多样性。

基因组重排技术以原生质体融合技术为基础，但基因组重排技术在于使用多亲本，而不是像原生质体融合一样使用双亲本。

进行多轮递归融合，能产生多样的突变组合，这将大大增加子代菌株的遗传多样性，提高了优良性状菌株的获得几率[35-36]。

（3）该技术简单实用，容易推广。

基因组重排技术对设备要求不高，费用较低，易于实施。

对工业微生物基因的结构和功能了解不详细，没有工业微生物的代谢路线图及其代谢调控机制等理论也能进行该技术的使用[35-36]，因此，普通的育种工作人员或者研究者在普通的一般实验室条件下就能开展相关实验。

1.3本论文研究的目的意义、思路设计及主要内容

1.3.1研究目的意义

本论文研究的主要目的和意义是：

然而，角蛋白酶的工业生产还有很多问题等着我们去解决，酶活力不高也是其中之一。

基因组重排技术是近年来兴起的高效的微生物育种技术，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，因此可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。

它可以快速、高效的选育出表现型得到较大改进的杂交菌种，具有广泛的应用。

通过基因重排技术筛选提高产角蛋白酶菌株产酶酶活力，有利于实现角蛋白酶的工业化生产。

1.3.2论文设计思路

本论文采用基因重排的技术方法，建立亲本基因组库，通过原生质体融合，得到融合子，并筛选高酶活力的融合子；

并通过单因素实验确定酶解最佳条件和融合最佳条件。

具体流程如图1-2所示。

图1-2本论文设计流程

Fig.1-2Thedesignprocessofthethesis

1.3.3主要内容

本论文主要从以下几个方面对课题进行研究：

（1）通过单因素实验确定BacilluslicheniformisX-47的最佳酶解条件和最佳融合条件；

（2）利用基因重排技术筛选角蛋白酶活力高的菌株。

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

地衣芽孢杆菌，BacilluslicheniformisX-47，由本实验室分离与鉴定[37]。

2.1.2药品与试剂

干酪素，Sigma公司；

葡萄糖，成都科龙化工有限公司；

牛肉膏，北京奥博星生物有限公司；

L-天冬酰胺，上海博奥生物有限公司；

溶菌酶，Lysozyme（EggWhite），BIOSHARP；

脱脂羊毛：

将制革废羊毛反复清洗，加入1%脱脂剂以及1%脱脂酶脱脂12h后乙醇浸泡一天，充分水洗后30℃干燥，用剪刀将其剪到<

1mm的碎段备用。

Folin甲试剂：

溶液1，称取0.5gCuSO4·

5H2O和1.0gNa3C6H5O7（H2O），溶解于100mL去离子水；

溶液2，称取20.00gNa2CO3和4gNaOH，溶解于1L去离子水；

溶液1和溶液2以1:

50的比例混合均匀。

Folin乙试剂：

称取100g钨酸钠（NaWO2

2H2O）和25g钼酸钠（Na2MOO4

2H2O）置2000mL磨口回流装置内，加700mL蒸馏水和100mL浓盐酸。

小火加热，回流10h，再加入150g硫酸锂（Li2SO4·

H2O），50mL蒸馏水及数滴液溴。

在通风橱中开口煮沸15min，冷却后定容至1000mL。

然后1:

1与去离子水混合均匀。

置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。

聚乙二醇PEG溶液：

PEG6000用高渗溶液配制；

300g/LPEG：

3gPEG6000溶解于10mlSMM，pH9.0；

400g/LPEG：

4gPEG6000溶解于10mLSMM，pH7.0，pH8.0，pH9.0，pH10.0，pH11.0；

500g/LPEG：

5gPEG6000溶解于10mLSMM，pH9.0；

0.06-0.07MPa灭菌30min；

高渗溶液（SMM）：

MgCl20.02mol/L；

顺丁烯二酸0.02mol/L；

蔗糖0.5mol/L。

以双蒸水配制，pH调至6.5，0.06~0.07MPa灭菌30min；

溶菌酶溶液：

使用前，称取一定量的溶菌酶用高渗溶液配置，使溶菌酶的浓度达到0.1mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL，3.0mg/mL，并经过0.22μm的无菌过滤器过滤；

新生磷酸钙：

分别配置1mol/LCaCl2溶液和0.02mol/LK2HPO4溶液，0.06~0.07MPa灭菌30min，使用时等体积混合；

其它试剂为分析纯。

2.1.3培养基

种子培养基（g/100mL）：

葡萄糖1.5g，K2HPO40.07g，L-天冬酰胺0.09g，

牛肉膏0.07g，NaCl4g，pH7.0。

筛选培养基（g/100mL）：

干酪素0.6g，牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl6g，琼脂1.5g，pH7.0

保藏培养基（g/100mL）：

牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaCl6g，琼脂1.5g，pH7.0

发酵培养基（g/100mL）：

可溶性淀粉4g，黄豆粉0.327g，K2HPO40.269g，

L-天冬酰胺0.13g，NaCl4g，脱脂羊毛0.2g，pH7.0-7.2。

2.1.4主要仪器设备

Cover-015光学显微镜

OLYMPUS公司日本；

SW-CJ-2FD型净化工作台

苏州净化设备有限公司；

DHP-9082电热恒温培养箱

上海一恒实验仪器有限公司；

HZS-H超级恒温水浴锅

哈尔滨市东联电子；

GL-20G-II型高速冷冻离心机

上海安亭科学仪器厂；

2112恒温摇床

上海福玛实验设备有限公司；

旋转蒸发水浴锅

上海亚荣生化仪器设备有限公司；

TGL/16M冷冻离心机

长沙湘麓有限公司；

722S型光光度仪

PE美国；

Sartorius分析天平

北京赛多利斯天平公司；

DHG-9070A型干燥箱

上海精宏实验设备有限公司；

2.2实验方法

2.2.1角蛋白酶活力分析方法

采用Lowry法测定角蛋白酶活力。

2.2.1.1酶活力标准曲线的绘制

标准曲线的绘制见附录1。

2.2.1.2角蛋白酶活力测定

加入4mL0.05mol/LpH10.0Gly-NaOH缓冲液和脱脂羊毛0.02g，再加入待测酶液1ml。

60℃培养30min，加入1mL20%TCA溶液以终止反应，空白对照组在加入酶液同时加入1ml20%TCA溶液。

然后室温静置60min后过滤掉不溶物，吸取1mL上清液，采用Lowry法检测其蛋白质的含量。

加入5mLFolin甲试剂，混匀在室温下放置5-10min；

加入1:

1稀释的0.5mLFolin乙试剂，立即混匀后于25℃条件下水浴25min,取出测定清液在波长750nm条件下的吸光度，然后与标准曲线对照测得角蛋白酶活力.

角蛋白酶活力的定义：

1mL酶液每30min释放1μg蛋白质（以牛血清为标准蛋白质进行折算）为一个活力单位（U）。

2.2.2原生质体的制备和再生

将实验室保存的地衣芽孢杆菌，BacilluslicheniformisX-47接种到斜面培养基活化12h，再接种到种子培养基，于温度37.0℃，转速180rpm再次培养24h，然后按6%的接种量接种到种子培养基中培养至OD值为0.8时停止，立即取下摇床，5000rpm下离心8min，弃上清液。

同样条件用生理盐水洗涤2次，高渗SMM溶液洗涤1次，最后用高渗SMM溶液等体积悬浮，制成的菌悬液，取适量菌液稀释进行活菌计数X。

取适量高渗菌体悬浮液于小三角瓶中，加入溶菌酶酶解，水浴低速震荡。

酶解后立即离心，弃去上清液，用高渗溶液洗涤一次，最后悬浮于等体积的高渗溶液中。

其中，溶菌酶浓度设置为0.1mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL,3.0mg/mL；

酶解时间设置为10min，20min，30min，60min，120min；

酶解温度设置为25℃，30℃，35℃，40℃，50℃。

用高渗溶液和生理盐水稀释进行活菌计数。

生理盐水为Y，高渗溶液为Z。

原生质体形成率（%）

原生质体再生率（%）

X：

处理前菌落数；

Y：

未被酶解的菌落数；

Z：

再生原生质体数和未被酶解的细菌数

2.2.3原生质体的灭活

将制备好的原生质体进行紫外灭活，其处理方式为菌液悬浮在平皿中于紫外灯下照射20min。

灭活处理后适当稀释，涂平板进行活菌计数，在37℃培养箱培养，计算原生质体灭活率。

2.2.4原生质体的融合及其条件优化

取灭活后亲本原生质体1mL液体，转速3800rpm，离心20min，去掉上清液，加入制备好的0.1mL新生磷酸钙溶液，混和均匀，再加入0.9mLPEG6000溶液，不同的温度下作用不同的时间，之后用高渗SMM溶液将其稀释，3800rpm，20min离心，去掉上清液，再用高渗SMM溶液定容到1mL，混和均匀后稀释涂布计数。

其中，选择优化的融合温度为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，选择优化的融合时间为5min、10min、15min、20min和25min，选择优化的PEG浓度为300、400、500g/L，选择优化的融合pH为7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

2.2.5融合子的检出

首先在再生培养基平板上挑选四周拥有透明圈的菌落，接种到保存培养基斜面上。

取得一定量的斜面后，进行融合子初筛：

分别从斜面试管中挑取一环菌体接种于盛有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，置于恒温摇床中37℃，180rpm条件下培养72h，然后将发酵液离心（4℃，10000rpm）5min，取上清液测定角蛋白酶活力。

将初筛得到的产酶活力较高的菌株进行复筛。

复筛过程与初筛相同。

第三章结果与讨论

3.1最适菌龄的确定

由于实验菌种长期保存，可能已经衰老退化，通过前期试验的观察，需要经过24小时复壮，然后把菌株接入种子培养基进行培养，得到地衣芽孢杆菌B.licheniformisX-47的生