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ABSTRACT
Staphylococcusaureus(Staphylococcusaureus)wasfirstdiscoveredin1884,RosenbachinthesolidculturemediumStaphylococcus,andinthesameyearrecordeditcancausefoodpoisoning.In1930,theresearcherspointedoutthatduetoStaphylococcusaureusenterotoxinfoodpoisoninganditsproducing,accordingtoestimates,foodintakeofabout100ngenterotoxinAcanappearpoisoningsymptoms.TypicalS.aureusisballshape,diameterofabout0.8μm,microscopearrangedthyrsoid,nonsporeforming,flagella,mostnoncapsule,belongingtothegrampositivebacteria.Atpresent,withthecontinuousdevelopmentofinternationalfoodtrade,pathogenicmicroorganismdetectionmethodsinfoodisalsoinconstantdevelopment,inaddition,traditionaltrainingmethodsinrecentyears,peopleadoptadvancedtechnologyinimmunology,biochemistryandmolecularbiologywerestudiedfortherapiddetectionofpathogenicmicroorganisminfood.ThereisnoexceptionforStaphylococcusaureus,traditionaldetectionmethodsofbacterialisolationcultureandidentificationofthebiochemical,immunologicalmethods(suchas:
ELISA,Westernblot,latexagglutinationmethodetc.)becauseofitsfast,simpleoperation,andgraduallyappliedtothedetectionoffoodhygiene.Butthenewtechniquesofmolecularbiologyhasshownitsuniqueadvantagesintheaspectsoffoodhygienedetection.Thispapermainlylaunchesaseriesofstudiesonthefourkindsofrapiddetectionmethods.
KeyWords:
food,Staphylococcusaureus,rapiddetectionmethod
食品中金黄色葡萄球菌的快速
检测方法研究
第1章绪论
1.1研究背景
金黄色葡萄球菌是一类广泛存在于自然界的空气、水、土壤以及人类和动物的排泄物中的革兰氏阳性菌,对营养条件的要求不高。
在非芽孢菌中,金黄色葡萄球菌对外界环境的抵抗能力最强。
金黄色葡萄球菌因为其分泌的毒素和侵袭性酶而引起食物中毒,如杀白细胞素、肠毒素、溶血毒素、血浆凝固酶和脱氧核糖核酸酶都是其分泌的毒素和侵袭性酶。
食品在生产销售的过程中,由于其加工前自身带菌,加工过程中被污染,包装密封不严格,生产或销售人员带菌以及在运输过程中都可能受到该菌的污染。
人一旦食用了被金黄色葡萄球菌污染的食物后极易引起食物中毒,会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状,严重的会导致死亡。
在我国的细菌性食物中毒事件中,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一,居于第四位。
在美国,每年也有超过十八万的人由于食用了被金黄色葡萄球菌污染的食物而中毒,其中约百分之一需要住院,造成严重的经济损失。
在欧盟国家,1993~1998年之间由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性疾病的4.5%。
有关日本的调查结果显示,大约三分之一的食品存在被金黄色葡萄球菌污染的可能。
根据美国CDC的调查报
告显示,金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的三分之一,仅次于大肠埃希氏菌,位居第二位。
而加拿大的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的45%。
由此可见,金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已呈现出全球的分布状态,已经成为世界公共卫生的一个重要问题。
随着人们生活水平的提高,对食品安全问题的关注也日益增加,国内外很多学者也致力于食品中致病菌的快速检测的研究。
目前,金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统平板方法的改进,以分子生物学为基础的核酸探针技术、聚合酶链反应技术(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)技术以及以免疫学理论为基础的免疫磁珠技术、酶联免疫技术(ELISA)、乳胶凝集技术、免疫荧光技术(IFA)。
传统检测方法的改进方法虽然成本较低,有较强的敏感性,但是检测时间较长,操作比较繁琐。
以分子生物学为基础和以免疫学为基础的检测方法虽然检测时间短,但是检测费用较高,灵敏性也相对较低,同时,某些检测方法对试验条件和实验人员的操作要求较高,不能得到普及。
因此,如何建立一种快速、操作简便、灵敏性高且经济的金黄色葡萄球菌检测方法已经成为国内外微生物研
究工作者的重要课题。
随着计算机技术的普及,计算机视觉技术在近几十年内也得到了突飞猛进的发展。
计算机视觉技术的应用领域涉及工业生产、气象观察、医疗诊断以及国防等多个方面。
也推动了其在生物、农业等领域烦的发展应用,如计算机视觉技术在农业中主要应用于农副产品的分级和品质检验、监测农作物的生长状况、以及农作物病虫害的防治等方面。
也有研究学者将其用于检测微生物,如SaurabhKumar、GauriS.Mittal把荧光染色技术和计算机图像处理技术相结合,用于检测病原菌。
孙钟雷
等人将显微图像处理技术应用于啤酒中酵母菌总数的检测。
在微生物的自动分类识别中,相对于人工肉眼识别,计算机视觉技术可以减少误差,能够快速、准确的检测食品中的微生物。
2009年10月1日21时30分,乌海市某酒店多位客人在该酒店就餐后陆续出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛症状,在乌海市人民医院接受治疗,怀疑食物中毒。
接到报告后,乌海市疾控中心组织专业人员会同市卫生监督所监督人员,立即对此事件进行了调查处理,现将结果报告如下。
根据流行病学调查、临床表现及实验室结果分析,依据GBl4938—1994《食物中毒诊断标准及技术处理总则》,可以判定这是一起食用被金黄色葡萄球菌污染的食物引起的细菌性食物中毒。
乾佳酒店婚宴菜品中鸭胸、夫妻肺片、鸡胗、肘花4种菜品为熟肉制品,属于我国最容易引发葡萄球菌食物中毒的食品之一。
金黄色葡萄球菌食物中毒流行病学特点为发病急,潜伏期一般为2-4h。
本次食物中毒13名患者中有4人发病潜伏期为2~4h,6人发病潜伏期为10—12h。
金黄色葡萄球菌食物中毒的临床表现为恶心、剧烈的反复呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道症状。
本次食物中毒13名患者的临床表现与之基本相符。
从中毒食品中经培养检出金黄色葡萄球菌(且前,乌海市疾控中心没有能力开展菌株的肠毒素检测)。
由于参加9月30日晚夜坐而未参加lo月1日中午婚宴的人员共5人,均未发病,因此可以确定中毒餐次为中餐。
鸭胸、夫妻肺片、鸡胗、肘花4种菜品检出金黄色葡萄球菌,因此可确定中毒食品。
1.2研究意义
随着人们生活水平的提高,人们对食品质量安全的要求日益增强,由于传统的检测方法存在诸多的不足,因此,研究一些操作方便、检测效率高、经济成本低、高准确度并且便于基层企业单位应用的微生物快速检测方法就显得尤为必要,这对整个食品行业来说可以实现微生物的及时检测,降低出厂后由于食品中微生物指标不合格带来的风险,减少其经济损失,具有重要的社会意义。
作为条件致病菌的金黄色葡萄球菌由于广泛存在于自然界中,因此食品受其污染的可能性很高,一旦食品受其污染后,在适宜的条件下会迅速增殖,并产生多种致病毒素,人一旦食用了这种被污染的食物,极易引起食物中毒。
而目前由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事例也屡见不鲜。
通过上述对金黄色葡萄球菌检测方法的分析可知,目前的金黄色葡萄球菌检测方法中没有一种检测方法同时具备检测时间短、检测成本低、检测准确性高且检测限低的条件。
因此,研究寻找一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法对食品的卫生控制具有重大的实际性意义。
1.3研究内容
本文共分为四个部分
第一部分为绪论。
提出该课题的研究背景、研究意义,对本文的研究内容做了大致地介绍。
第二部分为金黄色葡萄球菌简介,主要包括如下内容,即金黄色葡萄球菌生物学特征、金黄色葡萄球菌的致病性以及金黄色葡萄球菌的流行病学。
第三章为食品中金黄色葡萄球菌常用的检测方法,主要包括以下四种检测方法,分别为传统的检测方法、免疫学检测方法、以分子生物学为基础的快速检测方法、商业化快速检测方法。
第四部分为金黄色葡萄球菌四种检测方法的案例及分析。
对金黄色葡萄球菌四种检测方法的案例进行了介绍,并且做出分析。
1.4研究方法
本文主要采用的研究方法为文献资料法和对比分析法。
文献资料法。
本文查阅了大量相关的文献,并且从中提炼出比较有用的观点。
对比分析法。
对食品中金黄色葡萄球菌常用的四种检测方法进行了对比分析。
第2章金黄色葡萄球菌简介
2.1金黄色葡萄球菌生物学特征
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一种,属于革兰氏阳性菌。
直径为0.8~1.5μm,金黄色葡萄球菌无鞭毛、芽胞,少部分有荚膜,不能运动。
为需氧或兼性厌氧菌。
最适宜的生长温度为37℃,PH值为7.4。
金黄色葡萄球菌具有高度的耐盐性,在高盐培养基中可以良好的生长。
金黄色葡萄球菌还可以分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、核糖、松二糖、甘露糖产酸不产气。
其可以分解甘露醇,还可以产生溶血物质,因此在血平板上培养会产生溶血环。
其产生的血浆凝固酶可以使血浆产生凝固,这也是金黄色葡萄球菌区别于其他葡萄球菌的的主要性质。
还可以还原硝酸盐,产生脂酶和卵磷脂酶,因此在Baird-Parker培养基上培养的金黄色葡萄球菌可以在菌落周围产生沉淀环和透明圈。
金黄色葡萄球菌在一般的营养物质中就可以良好的生长,但是只有当生长条件如营养成分、温度水分活度、pH等条件适宜的情况下才会产生肠毒素,而肠毒素的产生是导致食物中毒的原因。
金黄色葡萄球菌抵抗外届不良环境的能力很强,在80℃条件下加热达到30min才能使其死亡。
2.2金黄色葡萄球菌的致病性
金黄色葡萄球菌可以产生多种毒素,这也是金黄色葡萄球菌导致食物中毒的原因,其分泌的毒素经过血清学鉴定包括14种,其中SEA和SED是细菌性食物中毒中最常见的肠毒素,其次是SEB、SEC。
当人体摄入几微克的肠毒素就可以导致食物中毒。
同时金黄色葡萄球菌还能产生α、β、γ、δ四种溶血毒素、这些溶血毒素可以导致血小板和溶酶体损伤,杀白细胞素、血浆凝固酶、表皮剥落毒素、毒性休克综合征毒素-1等多种致病性毒素。
有的毒素可以导致人的白细胞和巨噬细胞的损坏,有的可以导致血液中的纤维蛋白沉积,这些均可以导致人体治病。
此外,在人类的化脓感染致病菌中,金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌。
金黄色葡萄球菌甚至还可以引起人类的化脓感染,肺炎、心包炎等多种疾病。
2.3金黄色葡萄球菌的流行病学
在自然界的空气、水、土壤以及人类和动物的排泄物中均广泛的存在着金黄色葡萄球菌,在健康人的鼻腔、咽喉,头发上也有发现,因此,食品如果在生产销售环节中由于生产者操作不当均有可能导致金黄色葡萄球菌污染。
由于春夏季的气温和湿度都很高,金黄色葡萄球菌在这种环境下可以大量繁殖,容易导致金黄色葡萄球菌的季节性分布。
容易受金黄色葡萄球菌污染的食物种类繁多,其中以肉类制品、蛋类制品以及乳类食品为主。
含乳的冷冻制品次之。
由于金黄色葡萄球菌产生的食物中毒事件受到全球的关注,经过ICMSF(国际食品微生物规格委员会)的危害度评估,金黄色葡萄球菌被列为中度直接局部传播性病原菌。
日本对金黄色葡萄球菌的危害性评估结果与ICMSF的评估结果相同。
2.4金黄色葡萄球菌的耐药性分析
近年来,随着抗菌药物的广泛使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率有增高的趋势。
上海地区1985~1986年,MR-SA分离率为24%,1993~1994年分离率为60%,2001~2005年平均分离率为89%。
广州地区2000年分离率为50.8%,2003年分离率达70.8%。
任南等监测全国城市79家医院显示,MRSA分离率为79.93%。
江华等收集并分析了本院2009~2010年101株金黄色葡萄球菌的耐药情况,为临床合理使用抗菌药物提供参考。
此次本院分离出的101株金黄色葡萄球菌中MRSA占20.79%,提示本院细菌耐药情况控制得相对较好。
101株金黄色葡萄球菌中,青霉素和氨苄西林的耐药率分别为80.2%和77.23%,表现出高耐性。
对利奈唑胺100%敏感。
MRSA与MSSA对氯霉素、氯洁霉素、头孢唑林、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、苯唑西林、青霉素、利福平、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑、四环素、氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的耐药率进行统计分析,结果差异具有统计学意义(P<
0.05)。
金黄色葡萄球菌除对青霉素和氨苄西林表现出高耐药性外,体外抗菌活性均较好,尤其是利奈唑胺耐药率为0,可作为临床用药参考依据。
第3章食品中金黄色葡萄球菌常用的检测方法
3.1传统的检测方法
食品中金黄色葡萄球菌的国标检测方法多采用平板计数法,我国食品中金黄色葡萄球菌的检测是以GB4789.10-2010为依据。
该标准分为两个部分,一是定性检测,二是定量检测。
定性检测是将待检样品于无菌环境中接种到7.5%氯化钠肉汤或者10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,在适宜温度下培养一定时间后再将混合培养物划线接种到血平板或者和Baird-Parker平板上,培养后观察其特征,最后通过镜检和血浆凝固酶试验进行鉴定。
而定量检测采用的是将样品直接做10倍系列稀释液,然后选择适宜稀释度的样品接种到Baird-Parker平板上,在适宜的环境中培养一定时间,然后进行典型菌落的计数。
另外一种定量检测方法是将稀释好的三个梯度的稀释液分别接种于10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤中,每个梯度平行做3管,培养一定时间后在转接到Baird-Parker平板上进行再培养,然后对典型菌落进行确认,通过查MPN表进行金黄色葡萄球菌的定量检测。
金黄色葡萄球菌的肠毒素可以通过ELISA检测试剂盒对A、B、C、D、E型肠毒素进行检测。
国标法检测金黄色葡萄球菌准确,操作人员无需进行特殊的培训,但是也因为该法的检测时间长,整个过程需要4-5天,这就限制了其在食品工业生产实时检测中的应用。
因此,寻找一种快速、简单、经济、准确性高的金黄色葡萄球菌检测方法就成了时下研究的热点问题,国内外众多学者在致病微生物的快速检测上取得了可喜的成果。
3.2免疫学检测方法
尽管免疫学方法目前运用的较为广泛,但对于一些新近出现的肠毒素,如:
SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO等,目前还没有商业化的检测系统。
这样一来,以分子生物学为基础的方法就发挥着独特的优势。
3.3以分子生物学为基础的快速检测方法
随着分子生物学的不断发展,在病原微生物检测和研究方面,PCR技术成了除上述方法之外的很好选择。
PCR技术具有快速,特异性强、灵敏度高、检测限低以及可以成为自动化的趋势等优点,与传统方法相比,PCR的这些优点不断地鼓舞着人们去使用和研究。
PCR在食品微生物诊断和食源性疾病鉴定应用上有许多文献报道。
基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对PCR技术进行研究和改进,使PCR技术得到了进一步完善。
例如,在一个反应管中使用多套引物,针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程称之为多重PCR,可以满足同时分析不同DNA序列的需要,尤其是在致病菌的检测和科学研究时,在一个反应管中能够同时检测多种目标DNA,不仅能够节省实验样品,而且能使以往繁琐的操作变得省时省力。
PCR技术的另一个飞跃是荧光PCR,这项技术由美国AppliedBiosystems公司于1995年推出,不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,特异性更强、自动化程度更高,并能有效解决PCR污染问题,目前已得到较为广泛的应用。
荧光PCR技术是指在普通PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累检测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的一种方法。
荧光PCR技术在常规PCR基础上,添加了一条标记有两个荧光基团的探针。
一个标记在探针的5’端,称为荧光报告基团(R);
另一个标记在探针的3’端,称为荧光抑制基团(Q)。
两者可构成能量传递结构,即5’端荧光基团所发出的荧光可被3’端的荧光抑制基团吸收或抑制。
当二者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,这就是荧光共振能量迁移(FRET,FluorescentResonanceEnergyTransfer)原理。
荧光信号与PCR产物同比增长,随PCR产物的增加而增强,荧光PCR方法就是利用此原理,在PCR反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。
荧光PCR检测体系常用的荧光探针基本分为三种类型:
TaqMan探针、分子信标(molecularbeacon)和荧光杂交探针。
荧光PCR集扩增和检测于一体,直接闭管测定,无须分离和冲洗,操作简便快速,容易自动化,杜绝了产物污染源,并采用实时检测,大大提高了定量的准确性。
PCR技术检测金黄色葡萄球菌所选用的靶基因主要有:
肠毒素基因(sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,sej);
耐热核酸酶基因(nuc);
凝固酶基因(coa);
抗性基因(mecA,femA,ermA,ermB,ermC,ereA,ereB,aacA-aphD,tetK,tetM,vatA,vatB,vatC等);
16SrRNA基因;
影响生物被膜形成基因,如icaADBC等。
用于食品中检测金黄色葡萄球菌的靶基因主要是肠毒素基因和耐热核酸酶基因(nuc),耐热核酸酶基因具有特异性好的特点,自从PCR技术诞生,人们就一直应用nuc基因来检测金黄色葡萄球菌。
文献报道1991年PCR技术开始用于金黄色葡萄球菌检测,当时Wilson首次根据entB、entC1和nuc基因序列检测金黄色葡萄球菌。
1992年,Brakstad根据nuc基因检测金黄色葡萄球菌。
1993年,Chesneau报道了利用耐热核酸酶基因特异性检测金黄色葡萄球菌。
1996年,Piotr等人根据nuc基因和mecA基因,应用多重PCR快速检测抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
1997年,Saruta等应用巢式PCR对金黄色葡萄球菌进行快速检测和分型。
2000年以后,多重PCR检测技术和实时定量PCR技术在金黄色葡萄球菌检测中发挥着重要的作用,如:
Tamarapu发展了多重PCR检测乳制品中的金黄色葡萄球菌;
Chen等应用实时荧光PCR检测奶中的金黄色葡萄球菌;
Fischer等应用定量实时PCR和免疫方法相结合检测金黄色葡萄球菌肠毒素。
由此可见,利用多重PCR和实时荧光PCR技术是检测金黄色葡萄球菌的发展趋势。
3.4商业化快速检测方法
随着研究的深入,许多快速检测方法已经商品化,这些新的快速检测系统缩短了传统检测方法的时间,而且能够较快得到检测结果,操作相对简单。
利用生理生化的特性制造的试剂盒,如法国梅里埃公司生产的RPF试剂盒和API检测系统等。
利用免疫分析法和免疫荧光法制造的检测试剂盒,如StaphylococcusVIA(TECRA)、StaphylococcusETVIA(TECRA)、Staphylase(Oxoid)、VIDAS-STET(bioMerieuxVitek)和TransiaTubeSETtest(GENE-TRAK)等。
利用免疫胶乳微粒凝集实验发展起来的快速检测试剂盒,如SET-RPLA(UnipathLtd.)、Staph-RapidTest(Roche,Basel)、Staphylex(UnipathLtd.)、SlidexStaphkit(bioMerieuxVitek)、StaphylococcusLatex(HardyDiagnostics)、Monostaph(BionorA/S.)、Rida-Screen(R-BiopharmGmbHDarmstadt.)、DRYSPOTStaphytectPlus(Oxoid)、Staphytect(Oxoid)、SlideAgglutinationtest(BectonDickinson)。
基于DNA检测的试剂盒也已诞生,如:
Accuprobe
S.aureus(GenProbeInc.)、GENE-TRAKColorimetric(GENE-TRAK)和TAQMAN(PEAppliedBiosystems)。
这些方法操作简单但检测成本十分昂贵,我国极
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