DNA提取实验报告Word下载.docx
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使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。
2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴锅保温2-3小时,使酶切反应完全。
3、每管加入2υl0.1mol/ledta(ph8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱之保存备用。
四dna的琼脂糖凝胶电泳
1、取5×
tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml,配成0.5×
tbe稀释缓冲液,待用。
2、胶液的制备:
称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中,加入300ml0.5×
tbe稀释缓冲液,加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化,取出摇匀,此为1%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜,以减少水分蒸发。
3、胶版的制备:
想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(eb)溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。
倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则溶液出现气泡,待胶完全凝固后,拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5υ×
tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面
4、加样:
取20υl的酶解液与2υl10×
载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中,每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染,注意上样时要小心操做,避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿
5、电泳:
加完样后合上电泳槽盖,立即接通电源,控制电压保持在60-80v,电流在40ma以上,当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳
6、观察和拍照
五实验结果
六实验结论
通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解,右上第三第四根亮柱是我的结果。
结果显示,第三条中酶切效果良好,rna被降解的很完全,第四根没有被酶切,质粒dna跟rna同时存在,出现了两条亮带,质粒dna跟rna分离效果较好。
本实验需要细致认真的完成,所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项:
(1)取出梳子之前,一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固,拔梳子是一定要手稳,而且要
垂直拔出;
(2)点样要细心,枪头不要碰到凝胶,以免点样枪刺破凝胶;
(3)电泳时,电极一定要连接正确
(4)染色剂溴化乙锭是强诱变剂,有致癌性和强毒性,使用时一定要带一次性手套,使
用后废液不可不可随意丢弃。
生物科学071班姓名:
刘欢学号:
20073305篇二:
dna的提取和电泳实验报告
基因组dna的提取和电泳(实验五)实验报告
一、实验目的
了解dna提取的方法,以及琼脂糖凝胶电泳分析dna技术。
二、器材和试剂
1.器材
水平琼脂糖电泳仪,离心机,水浴锅,研钵,离心管、移液枪、水稻幼苗等
2.试剂
1.1mol/ltris.cl(ph8.0)的配制:
称取12.11g的tris,置于80ml的ddh20,加入浓盐酸
(约4.2ml),调节ph值至8.0,定容至100ml。
2.0.5mol/ledta(ph8.0)的配制:
18.61gna2edta·
2h2o,加入80ml的ddh2o,用naoh颗粒调ph值至8.0(约需2g),定容至100ml。
3.提取缓冲液的配制:
100mmol/ltris.cl(ph8.0),20mmol/ledta,500mmol/lnacl,
1.5%sds
4.80/4/16氯仿:
异戊醇:
乙醇
5.6?
loadingbuffer:
0.15%溴酚蓝,0.15%二甲苯青ff,5mmol/ledta,50%甘油
三、实验步骤
1.在15ml的离心管中加入5ml的提取缓冲液,60℃水浴预热。
2.植物叶1-2g,剪碎,在钵体中加入石英砂,加入预热的提取缓冲液,磨成粉末状,
60℃水浴保温20min,其间不时缓慢摇动。
3.5000rpm离心5分钟,仔细吸取上清液至另一离心管中,
4.加入5ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止皮肤损伤),室温下静置
5-10分钟,使水相和有机相混匀。
5.室温下离心5000rpm离心5分钟。
6.仔细吸取上清液至另一离心管中,加入一倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出
现絮状沉淀。
7.离心5000rpm,离心5min,弃去异丙醇,室温晾干。
8.视沉淀多少,加入1ml左右ddh2o溶解,可在60℃水浴中放置15分钟以上助溶。
9.取dna样品5μl,加入1μl6?
loadingbuffer,混匀,加入0.7%的琼脂糖凝胶加样孔
中,电泳,检测dna的分子大小。
4、实验结果和讨论
实验分析:
本次实验由于种种原因我是和植保102班的同学一起做的,我们组3人,实验过程比较严谨,受到了老师的表扬,实验结果也很令人满意。
下面是实验过程中的注意点:
1、研磨不能太久太用力,会导致dna片段断掉。
2、实验室的某些试剂,如氯仿,有毒性,应带手套进行。
电泳的时候不知是时间的原因还是都做得不错,结果相差不是很远(如上图),第五组和第六组是我们的,第六组是我自己加的。
实验过程中要耐心细心,这样才能得到满意的结果。
园艺101
石颖
20100107011篇三:
浙大生化实验报告dna的提取
实验报告
课程名称:
生化实验甲指导老师:
成绩:
__________________实验名称:
植物基因组dna的提取实验类型:
生化定性实验同组学生姓名:
及纯度与含量的测定一、实验目的和要求(必填)二、实验内容和原理(必填)三、实验材料与试剂(必填)四、实验器材与仪器(必填)五、操作方法和实验步骤(必填)六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析(必填)八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习并掌握植物基因组dna的提取原理和方法;
2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作;
3、学习并掌握对电泳检测基因组dna结果的初步分析;
4、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法;
5、学习并掌握紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量的方法。
二、实验基本原理植物基因组dna的提取方法就其提取原理主要有二种:
十六烷基三乙基溴化铵(ctab)法、十二烷基硫酸钠(sds)法。
十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和
核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使dna得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(dna、rna)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使dna沉淀,沉淀dna溶于te溶液中,即得植物基因组dna溶液。
由于植物中的次生代谢产物--多酚类化合物可介导dna降解,而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题,这些多糖能抑制限制酶、连接酶及dna聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。
传统的ctab-dna提取法步骤多,较烦琐,dna产率低,而且由于酚很难完全去除,容易影响以后的酶切等工作的效率。
sds法操作简单,温和,也可提取到较高分子量dna,但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响dna的限制性核酸内切酶酶切效果。
由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对dna的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
本实验采用十二烷基硫酸钠(sds)法提取植物基因组dna,基因组dna提取后,①通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组dna分子量大小、纯度;
②用紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量。
dna的琼脂糖凝胶电泳鉴定:
dna分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。
dna分子在高于等电点的溶液中带负电荷,它在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下,dna分子的迁移速度取决于分子筛效应,即具有不同的相对分子量的dna片段泳动速度不同。
dna片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(eb)染色后,在紫外光下可见橙红色带,并可确定dna片断在凝胶中的位置。
紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量
核酸--dna和rna所含碱基的苯环结构(嘌呤环和嘧啶环)的共轭双键具有紫外吸收的性质,它们在260nm处有最大的吸收峰。
因此,可以用260nm波长进行核酸含量的测定。
波长为260nm时,dna或rna的光密度的大小不仅与总含量有关,也与它们的不同构型而有差异。
对标准样品来说,浓度为1μg/ml时,dna钠盐的od260=0.02。
当od260=1时,双链dna含量约为50μg/ml
单链dna含量约为37μg/ml
rna含量约为40μg/ml
寡核苷酸含量约为30μg/ml(由于底物不同有差异)
1、核酸样品dna、rna含量的测定:
如用1cm光径石英比色皿,用h2o稀释dna或rna样品n倍并以h2o为空白对照,根据此时读出的od260值即可计算出样品稀释前dna的含量:
dna(μg/μl)=50×
od260读数×
dna样品稀释倍数/1000
rna(μg/μl)=40×
rna样品稀释倍数/1000
若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量,可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。
当dna样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响dna吸光度的准确测定。
由于dna在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。
所以,一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230,计算它们的比值来判断核酸样品的纯度。
2、核酸样品纯度判断的一般标准:
⑴dna纯度:
od260/od280≈1.8,表示为纯的dna;
od260/od280>1.9,表示有rna污染;
od260/od280<1.6,表示有蛋白质、酚等污染。
⑵rna纯度:
1.7<od260/od280<2.0,表示为纯的rna;
od260/od280<1.7时,表示有蛋白质或酚污染;
od260/od280>2.0时,表示可能有异硫氰酸残存。
⑶od230/od260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。
若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量;
同时也会影响酶切和pcr的效果。
三、实验材料与试剂
1、实验材料:
植物幼嫩叶子
2、实验试剂
(1)基因组dna提取缓冲液
(2)氯仿:
异戊醇:
乙醇抽提液
(3)te缓冲液
(4)平衡酚:
(5)rna酶a
(6)酚/氯仿
(7)氯仿/异戊醇
(8)异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。
(9)3mol/lnaac
(10)5×
tbe缓冲液
(11)6×
电泳上样缓冲液
(12)1.0%琼脂糖凝胶
(13)eb
(14)dna分子量markers:
125,564,2027,2322,4361,6557,9416,23130bp.
(15)ddh2o;
四、实验器材与仪器
1、研体
2、离心机、离心管(7ml、5ml)及离心管架;
3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头;
4、恒温水浴箱65℃
5、制冰机;
6、冰箱;
7、恒温水浴箱37℃;
8、微波炉;
9、电泳仪及电泳槽;
10、紫外检测仪。
11、紫外分光光度计;
12、石英比色皿(0.5cm光径)或1cm光径的微量石英比色皿(50ul、100ul)。
(二)琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna
1、制胶(1%琼脂糖凝胶)(此步骤由实验室老师准备)
在胶模上架好梳子。
称取01g琼脂糖,置于250ml锥形瓶中,加100ml0.5×
tbe电泳缓冲液,加热熔化至无颗粒状琼脂糖,待其冷却至50~60℃后,加入eb,使其终浓度为0.5mg/l,摇匀后立即倒入准备好的胶模中,待胶凝固后,放入电泳槽中,倒入适量0.5×
tbe(刚好淹过胶面),拔去梳子备用。
(注:
eb为诱变剂、致癌物,接触凝胶必须戴手套操作)
2、加样
取5ul纯化的dna原溶液样品,与1ul6×
电泳加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中(注:
勿划破或戳穿加样孔,勿带入气泡)。
若dna含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要换枪头以防互相污染。
注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3、电泳
加完样后,盖上电泳槽盖,立即接通电源,使电压调到100v,恒压电泳。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时,停止电泳(约需30~60min)。
4、观察和拍照
取出胶块置于紫外灯下观察,dna存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带,再用成像仪进行拍照,以便于分析。
紫外光对眼睛有害,观察时戴上防护镜或眼镜,或隔着玻璃或有机玻璃观察)。
紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量
将提取的植物基因组dna样品吸取20ul,加到新的5ml离心管中,再加一定量的ddh2o或te缓冲液(ph8.0)稀释100倍,用0.5cm光径石英比色皿(约需1.6ml样品溶液)或微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度。
计算植物基因组dna样品溶液的dna的含量以及dna样品的纯度。
六、结果与分析
(一)
这是电泳后得到的照片,其中从右往左数第七条带为我所做样品的基因组。
(二)紫外吸收法测定基因组dna纯度与含量
1、植物基因组dna样品溶液的dna的含量:
dna(μg/μl)=959.328ng/ul
2、植物基因组dna样品溶液的dna的纯度:
od260/od280=1.97
od230/od260=2.07
3、样品纯度判断:
⑴od260/od280≈1.8,表示为纯的dna;
⑵od260/od280>1.9,表示有rna污染;
⑶od260/od280<1.6,表示有蛋白质、酚等污染。
由od260/od280=1.97可知,样品含有rna杂质。
七、讨论、心得
注意事项:
影响dna泳动速率(迁移率)的因素有:
⑴dna分子质量的影响:
双链dna分子迁移的速率与dna分子量对数成反比。
分子量越大,迁移率越小。
⑵dna构型的影响:
超螺旋dna>线状dna>开环dna
⑶胶浓度的影响:
浓度越低,相同核酸分子迁移越快,一般常用的凝胶浓度为1%~2%;
⑷电场强度的影响:
电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。
但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,(一般5v/cm)(电场强度)。
而对于大片段电泳,甚至用0.5~1.0v/cm电泳过夜。
进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
⑸eb的影响:
溴化乙锭(eb)插入双链dna造成其负电荷减少、刚性和长度增加。
⑹电泳缓冲液的影响:
核酸电泳常采用tae、tbe、tpe三种缓冲系统,但它们各有利弊。
tae价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。
tpe在进行dna回收时,会使dna污染磷酸盐,影响后续反应。
所以多采用tbe缓冲液。
在缓冲液中加入edta,可以鳌合二价离子,抑制dnase,保护dna。
缓冲液ph常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。
⑺碱基组成与电泳温度的影响:
一般影响不大
在dna提取过程中必须始终注意以下几个关键问题:
(1)dna的二级结构和双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)的影响引起双链解开,即"
变性"
,因此抽提时避免使用变性的条件。
(2)抑制内外源dnase的活力。
dnase就象一把刀,它能把大分子的dna切成碎片,所以要加以杜绝,现可以通过多种途径来做到这一点:
a、低温操作;
b、调节ph,使偏碱(ph8.0);
c、抽提液中加表面活性剂;
d、加螯合剂(edta)除去酶的铺助因子(mg2+),使酶活性丧失。
(3)防止化学降解。
如过酸或过碱以及其它化学因素,会使dna降解,一般综合考虑,取ph8.0左右为宜。
(4)防止物理因素降解。
如温度太高或机械张力剪切等,dna分子特别大,极易被机械张力拉断,甚至在细管中稍急一些的流动也会使dna断裂,所以在抽提过程中要特别注意这一点,操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数,也不要剧烈摇动。
(5)植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。
因此,一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取dna的材料,这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少,dna含量高,且易于破碎,植物材料最好是新鲜的。
由结果可知,在加入rna酶的时候可适当多加一点,以免造成得到的dna样品含较多rna杂质。
篇四:
dna提取实验报告
注:
1、报告内的项目或内容设置,可根据实际情况加以调整和补充。
2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。
篇五:
dna提取及pcr扩增实验报告
pcr扩增及dna琼脂糖凝胶电泳
刘琳1131428环境科学
一、实验目的
1.学习并掌握pcr扩增的基本原理与实验技术。
2.对扩增后的dna进行琼脂糖凝胶电泳试验,并分析相应结果。
二、实验原理
1.pcr扩增
多聚酶链反应(pcr)技术的原理类似于dna的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板dna、四种脱氧核苷酸(dntp)、耐热taq聚合酶及两个合成dna的引物,而后加热使模板dna在高温下(94℃)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。
降低溶液温度,使合成引物在低温(55℃)与模板dna互补退火形成部分双链,这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温(72℃),在tap酶作用下,用四种dntp为原料,引物为复制起点,模板dna的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链,这是延伸阶段。
如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和dna合成这一循环,使产物dna重复合成,并在重复过程中,前一循环的产物dna可作为后一循环的模板dna而参与dna的合成,使产物dna的量按指数方式扩增。
经过30~40个循环,dna扩增即可完成。
2.dna琼脂糖凝胶电泳实验
dna分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下,dna分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
dna分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的dna分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用dna分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。
三、实验材料
仪器:
pcr扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂:
tapdna聚合酶、dntp、buffer、两种引物、16s全长dna样本、无菌ddh2o、模板dna、tbe、琼脂糖、eb、显色剂。
四、实验步骤
1.pcr扩增
本次试验选择细菌16srdnav3区片段进行扩增。
1.1根据计算,首先取1.5ml离心管按照2.5ul10×
buffer、1uldntp、0.5ul341gc、0.5ul534、0.125ultaq、19.375uddh2o的比例配置足量的pcr反应体系。
1.2分别向9个薄壁管中分别加入24ul的反应体系,并分别添加8种不同的模版,并于第9个薄壁管中加入无菌ddh2o作为阴性对照。
1.3将薄壁管放入pcr扩增仪中,按照预定程序进行pcr扩增。
其中循环过程需要达到30~40次。
程序如下:
预变性:
94℃3min
循环:
94℃变性30s
55℃退火30s
72℃延伸30s
末次延伸:
72℃5min
1.4pcr扩增完成后,将样品取出并
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