以植物叶子为材料测SOD酶活性实验方案.doc
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以植物叶子为材料测SOD酶活性实验方案.doc
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实验三氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性
一、实验目的
1、了解氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本原理。
2、掌握氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本操作方法。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
三、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
水稻或小麦等植物叶片。
(二)仪器设备
高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000Lx),试管或指形管数支。
(三)试剂
(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)。
91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05MNaH2PO4。
(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:
称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液:
称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存。
(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液:
称取0.03721gEDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。
(5)20µmol/L核黄素溶液:
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml,避光保存。
四、实验步骤
1、酶液提取
取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.52g于预冷的研钵中,加1ml预冷的磷酸缓
液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为4ml。
取4ml于4℃10000r/min离心20min
上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应
取10mL试管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:
各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要
各管受光情况一致,温度高,时间缩短,低时延长)。
3、SOD活性测定与计算
至反应结束后,全部移入暗处,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管的吸光度。
注意:
用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零,各试剂按比例混合好(3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5mlEDTANa2+0.40ml蒸馏水),再加100ul酶液,核黄素0.5ml最后单独加入。
总体积6.0mL
表10SOD活性测定的试剂量
试管编号
1对照(不光照)
2对照(光照)
3
4
缓冲液(mL)
3.50
3.50
3.50
3.50
甲硫氨酸(mL)
0.50
0.50
0.50
0.50
氮蓝四唑(mL)
0.50
0.50
0.50
0.50
EDTANa2(mL)
0.50
0.50
0.50
0.50
蒸馏水(mL)
0.50
0.50
0.40
0.40
酶液
0
0
0.10
0.10
核黄素
0.50
0.50
0.50
0.50
测定结果
0
Ack
AE1
AE2
表11SOD活性测定(平行测定2次)的Abs
试管号
2对照(光照)
3
4
平行测定次数
第一次
第二次
第一次
第二次
第一次
第二次
吸光度A(Abs)
0.203
0.251
0.055
0.199
0.035
0.140
五、结果计算
计算公式:
SOD(U/g.FW)=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs
式中
VT-总酶液量(ml)
Vs-所用酶液量(50ul)
W-叶片鲜重(g)
Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度
AE-样品管吸光度
表12SOD活性的计算
VT=400uLVs=50uLW=0.52g
平行侧定次数
第一次
第二次
样品管管号
3
4
3
4
SOD(U/g.FW)
0.224
0.255
0.064
0.136
六、实验结果分析讨论
11
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