生物技术制药实验的指导Word格式文档下载.docx
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医药工业则被誉为21世纪的“朝阳产业”,特别是现代生物技术的迅速发展,更促进了当今世界制药工业的迅猛发展。
科学技术的发展、新技术的不断涌现对我国这样的发展中国家来说,既是挑战,也是机遇,而能否抓住发展机遇关键在于提高全民族的科学文化水平,造就一支具有科学精神、懂得科学方法、具有知识创新和技术创新能力的高素质劳动者队伍。
所以,发展和普及科学知识、弘扬科学精神、提倡科学方法是我们应对世纪挑战的首要策略。
为此,1999年8月,江总书记在视察中国科学院大连化学物理研究所时进一步强调了科普工作者的重要性:
“在加强科技进步和创新的同时,我们应该大力加强全社会的科学普及工作,努力提高全民族的科学文化素质。
这项工作做好了,就可以为科技进步和创新提供广泛的群众基础。
”所以我们应加速现代生物技术制药的人才培养,以迎接21世纪的挑战。
生物药物包括从动物、植物、微生物、人和各种海洋生物中制取的以及运用现代生物技术产生的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。
它在医疗上具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小疗效可靠及营养价值高等鲜明、显著的特点,已越来越受到人们的青睐和重视。
而近半个世纪生命科学的飞速发展给生物药物的开发和利用赋予新的生命,使生物药物成为当今发展最快、影响最大的药物之一。
本书着重介绍生物技术制药过程中涉及的重要方法和技术,可根据时间和要求情况,选用部分实验。
每个实验后面都附有相关的思考题,书后编有附录,可供读者查阅。
王金华主编
2003年12月于昆明
实验一生物药物原料的选择、处理与保存
一、目的要求
了解各种不同生物药物原料的来源,学习并掌握各种原料的选择原则、处理及保存方法。
二、基本原理
生物药物原料以天然的生物材料为主,包括人体、动物、植物、微生物和各种海洋生物等。
生物药物的提取与分离方法因为原材料、药物的种类和性质的不同而有很大差异。
因此在选择时应注意选择有效成分含量高、原料新鲜、来源丰富、杂质含量少的原料,还要选择最佳采集时间。
原料的处理依原料种类的不同而不同。
动物原料采集后要立即处理,去处结缔组织、脂肪组织等,并迅速冷冻贮存;
植物原料确定后,要择时采集并就地去除不用的部分,将有用部分干燥、保鲜处理;
微生物原料收集时,要及时将菌细胞与培养液分开,进行保鲜处理。
原料的保存方法主要有三种:
冷冻法、有机溶剂脱水法和防腐剂保鲜法。
本实验着重介绍有机溶剂脱水法。
有机溶剂脱水法:
植物、动物组织中常含有较多的脂肪和微生物,该类物质不仅容易氧化酸败,导致原料变质,而且还会影响纯化操作和制品收率。
因此将动、植物原料置于脂溶性有机溶剂(如丙酮、乙醚)中进行脱脂、脱水,制成丙酮干粉,长期保存。
三、器材
剪刀,研钵,离心机,表面皿,冰箱
冷丙酮
四、操作步骤
1、取植物组织(芹菜叶片)适量(10-20g),用水洗净,甩干;
2、用剪刀将之剪碎,放入研钵,加入5V的冷丙酮,研磨成浆糊状;
3、将浆糊状研磨物倒入50ml离心管,-20℃,静置30min;
4、取出,于4℃,4000rpm,离心20min;
5、倒去上清液,将沉淀拨至表面皿中,室温自然风干,制成丙酮干粉,4℃可长期保存。
五、实验报告
思考题:
1、各种不同生物药物原料的选择原则是什么?
2、不同生物药物原料的处理及保存方法有哪几种?
实验二包埋法制备固定化细胞
了解细胞、酶固定化的方法,掌握固定化细胞、固定化酶的定义和固定化后细胞和酶的性质变化,以及包埋法固定化细胞的方法。
固定化细胞主要是利用细胞中的酶类催化小分子的底物进行酶反应。
酶反应几乎都是在水溶液中进行的,属于均相反应。
均相酶反应系统自然简便,但是也有许多缺点,如溶液中的游离酶只能一次性利用,不仅造成酶的浪费,而且会增加产品分离的难度和费用,影响产品的质量;
另外溶液酶很不稳定,溶液变性和失活。
如能将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不溶于水的固行物,即固定化酶(或固定化细胞),则可像一般固定催化剂那样使用和处理,就可以大大提高酶的利用率。
与固定化酶类似,细胞也能固定化。
生物细胞虽然属于固相催化剂,但是因为其颗粒微小难于截留或固定,也需要固定化。
固定化细胞既有细胞特性和生物催化剂的功能,也具有固相催化剂的特点。
被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞,固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法和无载体法等。
包埋法是将细胞定位于凝胶网格内的技术,常用的载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶和海藻胶。
从海藻中提获得的藻酸盐(常为钠盐),是D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物,多价阳离子(如Ca2+、Al3+)可诱导其形成海藻凝胶。
将微生物细胞或酶与藻酸钠溶液混合后,通过注射器针头将上述混合液滴入CaCl2溶液中,Ca2+从外部扩散进入藻酸钠-细胞混合液珠内,使藻酸钠转变为不溶的藻酸钙凝胶,由此将细胞或酶包埋其中。
10ml注射器,5#针头,烧杯,三角瓶,离心机,磁力搅拌器,玻棒
光合细菌,4%海藻酸钠溶液,2.5%CaCl2
1、将光合细菌培养液在4000rpm离心20min后,收集菌体于烧杯中,备用;
2、向烧杯中的菌体加入等体积的ddH2O,制成稀的悬浮菌液;
3、按照1:
5的比例将悬浮菌液缓慢倒入4%藻酸钠溶液中,并用玻棒不断搅拌,使之充分混匀;
4、用注射器吸取10ml上述菌体-藻酸钠混合液,加上针头,滴入正在进行磁力搅拌的2.5%CaCl2溶液中;
5、倾去CaCl2溶液,用ddH2O冲洗藻酸钙凝胶珠3次,滤干,4℃备用。
1、藻酸钙凝胶珠为什么呈现均匀的红色?
2、固定化细胞、固定化酶的优点有哪些?
3、与固定化之前的细胞、酶相比较,固定化细胞、固定化酶的性质有了什么变化?
实验三吸附层析提取鸟巢菌素
学习吸附层析的基本原理和方法,掌握硅胶正相吸附层析的基本工艺流程。
吸附现象是表面的一个重要性质之一,是指固体表面对气体分子或液体分子的吸着现象,其作用力可以是物理吸附作用,也可以是化学吸附作用,如范德华力、静电力、共价结合力以及氢键作用等。
吸附色谱就是利用固定相对混合物中不同物质的吸附力不同而使其中的不同组分相互分离的方法。
硅胶(SilicaGel)是常用无机基质层析剂,它的化学成分是二氧化硅,它其实是分子量巨大的无机高分子。
用作吸附层析分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅,其特点是表面含有很多硅羟基团(或称硅醇基团),参与各种化学键合和疏水吸附,用于层析。
一般认为,硅胶表面的硅羟基团可以有3种不同的类型(图3-1),其中以自由(或孤立)硅羟基对各种键合反应最为重要。
图3-1硅羟基的类型
硅胶(柱层析用),层析柱系统装置,烧杯,玻棒
鸟巢菌发酵液,甲醇,氯仿,ddH2O
1、将硅胶用等体积的甲醇溶胀;
2、装柱;
3、用2~3V体积的甲醇平衡层析柱,流速2ml/min;
4、将浓缩的鸟巢菌发酵液样品上样;
5、甲醇-氯仿梯度洗脱,观察洗脱现象;
6、收集洗脱样品,2ml/tube;
7、将各组分样品于4℃保存,待检测。
1、分析所收集到的各段产物的疏水性强弱。
2、了解其他层析介质的性质和分离纯化依据。
实验四液相层析分离、纯化蛋白质类药物
学习凝胶过滤层析分离、纯化物质的基本原理和方法,掌握凝胶过滤层析的基本工艺流程。
凝胶过滤层析,也称为分子大小排阻层析,是一种根据蛋白质类物质分子的大小和形状来进行分离的方法。
与其他类型的层析技术不同,在理想的理论情况下,凝胶过滤不涉及蛋白质与填料(凝胶)之间的吸附或排斥作用。
凝胶过滤柱是由均匀装填的多孔凝胶微粒组成,蛋白质是基于不同蛋白质通过这些微孔的迁移能力的不同而被分离的。
如果一蛋白质的大小与微孔的大小相比很大,它永远也不会进入这些微孔,在通过层析柱时它就会在凝胶颗粒外面绕行而不是从颗粒内穿行。
如果一蛋白质或小分子(如缓冲液的成分)与凝胶过滤填料上的微孔相比很小,这些小分子就会不受阻碍地在凝胶颗粒内穿行,实际上,颗粒对于小分子来说已成了无形之物。
因此,大的蛋白质将比小分子更迅速地迁移通过凝郊过滤柱。
SephacrylS-300HR凝胶,吸管,柱色谱分离装置,eppendorf管
淀粉酶工程菌株,ddH2O,0.05MNaAC溶液
1、将SephacrylS-300HR凝胶用0.05MNaAC-HAC缓冲液平衡后,装柱;
2、用0.05MNaAC缓冲液过柱1h,充分平衡层析柱,流速2ml/min;
图4-1柱色谱分离装置
图4-2凝胶色谱分离原理示意图
3、将浓缩的淀粉酶工程菌发酵上清液样品上样;
4、用0.05MNaAC缓冲液洗脱;
5、收集各洗脱峰样品,收集速率为10sec/tube;
6、将各组样品于4℃保存,待检测。
7、层析柱再平衡。
1、绘制凝胶色谱分离、纯化不同分子量蛋白质类物质的原理过程图。
2、比较凝胶色谱和其他类型色谱的差异。
3、凝胶色谱分离出的物质其流出的先后顺序和其分子量大小之间有关系吗?
如果有,那么二者关系如何?
实验五半成品药物质量检测
———蛋白质含量测定
学习蛋白质含量测定的方法——lowry法的基本原理,并掌握该法的操作。
用于蛋白质测定的lowry反应是双缩脲方法的发展,首先是在碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin试剂),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色的复合物在500nm处有最大的吸收峰,颜色深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据500nm的光吸值大小计算蛋白质的含量。
这个测定方法灵敏,但费时。
进行测定时,加Folin-酚试剂要特别小心,因为Folin-酚试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只是在pH10的情况下发生,故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
分光光度计,比色杯,试管,试管架,加样枪,枪头,震荡器,一次性手套,量筒,滤纸,洗瓶
0.25mg/mlBSA,4%Na2CO3,0.8%NaOH,1%CuSO4,2%酒石酸钠,Folin-酚试剂
SPSS数据处理软件系统
1、将4%Na2CO3:
0.8%NaOH=1:
1,制备A液;
2、将1%CuSO4:
2%酒石酸钠=1:
1,制备B液;
3、将A:
B=50:
1,制备C液;
4、取0.25mg/mlBSA0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,分别加入5支试管中,用ddH2O补充至1.0ml;
5、取样品1.0ml于另一支试管中;
6、向每支试管中加入C液5ml,震荡器混匀,静置10min;
7、再向每支试管中加入Folin-酚试剂0.5ml,混匀,静置30min;
8、测定OD500,ddH2O做对照。
9、已光吸值为横坐标,蛋白质浓度(或者含量μg)为纵坐标,绘制标准曲线作为定量的依据。
1、绘制标准曲线,用SPSS软件处理所得数据,并求出回归方程。
图5-1lowry检测法标准曲线
2、由标准曲线中的回归方程求得样品中蛋白质浓度,并将浓度单位换算成mg/ml。
实验六蛋白质药物相对分子量测定——SDS-PAGE
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的基本原理,学习并掌握电泳测定蛋白质分子量的方法。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速,而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途,使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
图6-1凝胶电泳原理示意图
A.电泳开始前B.电泳结束时
垂直凝胶电泳装置,微量加样枪,电泳仪,沸水浴,eppendorf管,摇床
丙烯酰胺,N’,N’-甲叉双丙烯酰胺,Tris-base,SDS,TEMED,10%过硫酸铵,α-巯基乙醇,甘油,溴酚蓝,甘氨酸,盐酸,DTT,考马斯亮蓝R-250,甲醇,冰乙酸
1、组装凝胶模具,如图6-2所示;
图6-2凝胶模具组装示意图
溶液
用量(10ml)
A液
2.7ml
B液
2.5ml
蒸馏水
4.8ml
10%过硫酸铵
50µ
l
TEMED
5µ
图6-3用滴管将灌制分离胶
2、灌制分离胶;
举例:
两块8%的分离胶(6cm×
8cm×
0.75cm)
小心地将上述凝胶溶液加入模具内,如图6-3所示,等待60min,使凝胶聚合;
用量(4ml)
A液
0.67ml
C液
1.0ml
2.3ml
30µ
3、灌制浓缩胶
两块5%的分离胶(6cm×
8cm×
小心地将上述凝胶溶液加入模具内,插入梳子,如图6-4、6-5所示。
等待30min,使凝胶聚合后,小心拔出梳子,不要将加样孔撕裂。
将电泳缓冲液加入电泳槽;
图6-4将浓缩胶溶液用吸管加入凝胶模具图6-5将加样孔梳子插入浓缩胶
4、制备样品和上样:
样品加入等体积的样品缓冲液,在沸水浴中加热5min,取出,冷却,用微量加样枪加入上样孔中,如图6-6所示;
图6-6将蛋白质样品加入样品孔中
5、电泳(200V,100mA,3h);
6、考马斯亮蓝染色
(1)染色25min;
97.4kD
66.2kD
43.0kD31.0kD
20.1kD14.4kD
12345678910
(2)脱色30min。
图6-7蛋白质凝胶电泳结果图
2某发酵原液,1,3-5,9初纯样品
6-8纯样品,10ProteinMarker
1、以相对迁移率为横坐标,lgMW为纵坐标绘制标准曲线。
图6-86种标准蛋白质和其他蛋白质凝胶电泳测定的标准曲线
2、由该标准曲线,根据迁移率Rf,测定样品蛋白质的分子量。
3、异常迁移的原因是什么,如何解决?
实验七蛋白质药物纯度检测——SDS-PAGE
了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的基本原理,学习并掌握电泳测定蛋白质纯度的方法。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行特性鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
因此可以利用SDS-PAGE分析蛋白质混合物的纯度。
同实验六
1、组装凝胶模具;
4、制备样品和上样
1、根据染色的电泳胶板,分析各泳道样品的纯度。
2、如果应该出现单一蛋白质条带的情况下出现了双带,有可能是哪些原因造成的?
3、某一样品出现两条带,是否一定代表该样品不纯?
为什么?
实验八抗体诊断——玻片直接凝集法检测血型
学习并掌握抗原抗体凝集反应的原理和方法,了解凝集现象;
知道人类ABO血型系统的分类。
血液制剂是在输血疗法的基础上发展起来的。
输血的真正开始应该是从维也纳大学病理解剖学会的青年助理KarlLandsteiner(1868—1943)发现血型开始的,1900年他首次发表其研究结果。
后来经过其他科学家进行完善,国际联盟卫员会制订并公布了统一的国际命名法,即ABO血型系统命名法。
ABO血型系统在人类的ABO血型系统中,红细胞膜上存在有不同的抗原物质,即凝集原A和凝集原B;
与此相对应,血清中则含有特异性抗体,即α(或称抗A)凝集素β(或称抗B)凝集素。
根据红细胞上所含有凝集原种类的不同,可把人类ABO血型系统分为四种不同的血型:
凡含有凝集原A而血浆中不含有α凝集素的血液为A型;
凡含有凝集原B而血浆中不含有β凝集素的血液为B型;
凡无αβ凝集素,而仅含有凝集原A、B的血液为AB型;
凡无原A、B凝集原,而仅含有αβ凝集素的血液为O型。
当一个人的红细胞同另一个人的血清混合时,有时可看到红细胞彼此凝集在一起,这种现象称为红细胞凝集反应。
这种现象正是红细胞表面抗原与血清中相应的抗体相遇时发生的凝集反应。
一次性采血针,酒精棉球,镊子,玻棒,双凹玻片,记号笔
标准血清A、B各一盒
1、取双凹玻片一片,左上角写“A”,右上角写“B”,分别加入一滴标准血清A、B;
2、采指端血;
3、用玻棒两端分别取血少许,分别放入A、B标准血清,混匀;
4、静置5min;
5、观察。
1、绘制人ABO血型系统抗原抗体凝集反应图表。
(+)阳性反应(-)阴性反应
人红细胞与血清的反应
人血清与红细胞的反应
解释
抗A
抗B
A细胞
B细胞
O细胞
ABO血型
2、根据凝集结果确定自己的血型。
实验九单克隆抗体的制备
了解单克隆抗体的特性和功能,掌握单克隆抗体的产生机制和制备过程。
当动物细胞受到抗原的刺激作用之后,便会在动物体内引起免疫反应,并形成相应的抗体。
这种抗原-抗体之间的应答反应是一种相当复杂的过程。
由于一种抗原往往具有多种不同的抗原决定簇,而每一种抗原决定簇又可以被许多种不同的抗体所识别,因此事实上每一种抗原都拥有大量的特异性的识别抗体。
单克隆抗体是指由单一的B淋巴细胞克隆产生的,针对一个抗原决定簇的抗体。
单克隆抗体的制备方法主要两种:
动物体内诱生法和体外培养法。
三、试剂及器材
1.BALB/c小鼠(成年小鼠或经产母鼠)。
2.降植烷(pristane,2,6,10,14—四甲基五癸烷)或液体石蜡。
3.杂交瘤细胞:
经DMEM—0培养液离心洗涤1次后,用同样培养液或生理盐水将杂交瘤细胞浓度调为106个/mL。
离心管(10mL)、吸管、注射器(2mL)、注射针头(7号)、细胞计数板。
甩干式转头离心机、显微镜、计数器
四、操作方法
在接种杂交瘤细胞前,先给小鼠(BALB/c小鼠)腹腔注射0.5mL降植烷(pristane)或液体石蜡。
然后每只小鼠腹腔注射5×
105~106个杂交瘤细胞。
接种杂交瘤细胞约7~10日后,小鼠腹部明显涨大,此时可用左手固定小鼠,用75%乙醇消毒其腹部,再于小鼠下方放置一支试管,将灭菌的注射针头(7号)刺入小鼠下腹部,让腹水滴入管内。
图9-1单克隆抗体的制备过程示意图
当腹水停滴时,可轻轻移动针头或轻揉其腹部,使腹水继续滴出。
1次可获5~8mL腹水,间隔2~3天,待腹水再积累后,同法再取腹水,一般可取腹水2~3次。
收集完腹水后,即以1500r/min离心10分钟,吸取上清液,加入0.02%叠氮钠,分装保存于-20℃。
提取纯化抗体(可以采用层析、电泳等方法),并进行必要的特异性检验(酶联免疫法检测)
1.动物体内诱生单克隆抗体法
将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内,便可诱生腹腔肿瘤和产生含单克隆抗体的小鼠腹水,抗体浓度可达1-10mg/ml,此法尚可有效地保存杂交瘤细胞和分离被杂菌污染的杂交瘤细胞。
2.体外培养产生单克隆抗体法
在实验室条件下,可采用静止培养法,以含10%胎牛血清的DMEM和2×
106个/mL细胞浓度为最佳培养条件,一般可获10-50µ
g/mL的单克隆抗体。
也可用装有搅拌器或气泡搅拌的发酵罐进行体外大量培养杂交瘤细胞,生产大量单克隆抗体
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