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1、国内中药制剂分析现状
1)光谱法的应用
A比色法如丹参素/丹参注射液,阿魏酸/当归浸膏--定量
B紫外-可见分光光度法
单波长法如蒽醌/何首乌,香豆素/祖师栗膏--定量;
双波长法靛蓝、靛玉红/喉痛消炎丸--定量;
三波长法小檗碱/三黄片--定量;
一阶导数光谱法绿原酸/感冒咳嗽冲剂,麻黄碱/哮喘丸--定量
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二阶导数光谱法胆酸/清宫冲剂,血竭/七厘散--定量;
三阶导数光谱法氢溴酸东莨菪碱/中麻2号注射液--
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C荧光法丹参素/丹参注射液
D红外分光光度法
--体/山道年;
番木鳖碱、马钱子碱/马钱子
E质谱法
F核磁共振光谱法
2)色谱法的应用
A纸色谱法已较少应用;
B薄层色谱法应用广泛;
C棒状薄层色谱法小檗碱/复方黄柏制剂、人参皂甙/人参、胆酸和去氧胆酸/
熊胆--定量;
D气相色谱法挥发性成分定量
冰片/复方丹参片/牛黄解毒丸/冠心苏合丸等;
厚朴酚、和厚朴酚/藿香正气水,麻黄碱/葛根汤;
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E高效液相色谱法应用广泛,以反相HPLC为主;
黄连素/半夏泻心汤,红景天甙/红景天口服液,甘草酸/千金升白冲剂等。
3)电化学分析法的应用
A库仑法
B电位法药物电极测定法和电位溶出分析法
4)其他
A原子吸收光谱法和冷原子技术
B原子发射光谱
CX射线分析法
目前,中药体系存在的突出问题具体表现在:
(1)定量分析指标与其主要药效作用间缺
乏相关性;
(2)与化学药物相比,中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系,目前还没有建立起一套有效的中药复杂体系定量分析标准。
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2。
国内中药制剂分析发展趋势
(1)中药有效成分的筛选与确定;
应用仿生学、基因组学等学科的理论和进展,发现新的药物靶标,从分子、基因、受体、组织和整体水平系统准确地确定中药复杂体系中的药效物质;
(2)中药有效成分的提取与分析;
中药化学成分非常复杂,而且有效成分也具有相对性。
为了高效率地提取中药有效成分,应用各种现代提取技术,如SFE、SWE、UAE等,可用于
中药复杂体系中有效成分的提取,利用准确的仪器分析方法和计算机技术,通过因子分析方法对中药复杂体系进行定性定量评价;
(3)中药药效物质与中医药理论相关性研究;
利用现代分析方法研究中药复杂体系中药效物质与中医药理论的定量关系,并结合现代医学理论,阐明其作用机制,在此基础上对中药及其复方进行全面质量控制。
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第二节中药制剂分析工作的基本程序
中药制剂分析程序一般可分取样、测试样品溶液的制备和测定(包括定性鉴别、杂质检查、含量测定)等。
一、取样
1.供试品要具有代表性:
原则是均匀、合理。
2.严格按照规定的取样方法进行取样:
一般应从每个包装的四角和中央五处取样,
深度可达1/32/3处。
取得的样品装入清洁、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中,并注明品名、批号、数量、取样日期及取样人。
3.抽取供试品的数量:
各类中药制剂取样大致是至少够3次检验的用量。
贵重药
品可酌情取样。
粉状制剂(散剂、颗粒剂)一般取样100g,可从包装的上、中、下三层及周围间隔相等部位取样若干,将所得样品混匀,按〝四分法〞从中取出所需供试量。
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液体制剂(口服液、药酒、糖浆、酊剂等)一般取样200ml。
同时须注意均匀取样。
固体中成药(丸剂、片剂)成品取样一般为100g,压片后取样200片。
丸剂一般取
10丸。
胶囊剂称取不少于20个胶囊,倾出其中的药料,称定空胶囊的重量,由总重
中减去,即为胶囊内药料的重量。
依标示量及供试量称取部分药料供分析。
一般取样量为
100g。
注射液的取样,灌注、熔封,灭菌前后应经过两次分析。
灌封前将注射液混合均
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匀,如液体取样原则取样,再按标示量及供试量分别取部分进行检验;
经灭菌后的注射液
须按原来的方法进行分析检验。
已封好的安瓿,取样量一般为
200支。
其它剂型的中成药,可根据具体情况随意抽取一定数量,作为随机抽样。
供试样品检验完毕,应保留一半数量作为留样观察。
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二、测试样品溶液的制备
中药制剂测试样品溶液的制备一般分为提取、分离、净化等过程。
1.中药制剂样品的提取
冷浸法,6~10~20倍药重溶剂,称重,浸泡12~24~48小时,称重,,等分取样或取总样
测定。
适宜遇热不稳定的有效成分;
连续回流法,样品置索氏提取器中,利用溶剂反复提取,提取效率高,溶剂少,遇热不稳定的有效成分不宜用此法;
超声波提取法,样品置容器中,溶剂提取,效率高,一般样品30min内即可完成。
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2.中药制剂样品的预处理
液-液萃取法:
溶剂直接萃取、离子对萃取,操作繁,易乳化。
沉淀法:
采用某些试剂沉淀杂质或沉淀待测成分。
蒸馏法:
利用待测成分或其分解产物具有挥发性的特点,采用蒸馏法、收集馏液进行含量测定,必须明确测定成分的结构才可用此法。
色谱法(液-固萃取法),常用净化剂有三氧化二铝、氧化镁、硅胶、活性炭、大孔
树脂、离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等。
其中离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等目前有较多商品预处理柱,使用方便,操作简单,净化效率高。
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三、定性鉴别、检查和含量测定
1.定性鉴别
1)性状鉴别系指中成药的形状、颜色、气味等,凡药典收载品,在药典中均有规定,可按要求进行检查。
2)显微鉴别因为含有中药原粉的中成药均保留中药材的显微特征。
可以通过
这些特征,对中成药进行定性鉴别。
3)理化鉴别药典中常用的方法有:
荧光法、显色法、沉淀法、微量升华法;
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纸色谱法、薄层色谱、液相色谱、气相色谱等。
中药定性鉴别应选择其中主药(君药)、辅药(臣药)作为主要对象,其次应鉴别毒剧药及贵重药材。
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2.检查
按我国药典要求,中药制剂需要检查的项目大致可分为三类:
1)污染型中成药一般杂质检查项目有:
异物、灰分、酸不溶性灰分、重金属、
砷盐等;
卫生学检查:
微生物细菌检查;
以及有的产品要求农药残留量的检测。
2)特殊杂质型原料药材掺假、有毒成分的限量检查。
3)剂型的要求检查类型(制剂通则要求检查项目)
中成药一般质量要求的检查有:
挥发油测定、水分测定(固体制剂)、乙醇含量测定、
总固体、相对密度、pH值(酊剂、药酒)、装量差异(片重差异)、崩解度(片剂、胶囊剂)、熔点测定、旋光度测定等。
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3.含量测定
中成药含量测定所采用的方法除经典的重量法、容量法(包括中和法、容量沉淀法、
络合滴定法、氧化还原法及非水溶液滴定法等)外,还可采用电位法、库伦滴定法、比色法、
可见-紫外分光光度法、红外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、双波长薄层扫描法等。
1)对有效成分明确的中药制剂要进行有效成分的含量测定。
2)大致明确有效成分,要求测定这些成分的总量。
3)对有效成分已知但无理想的测定方法的中药制剂,可通过测定其中某些化学成分的含量间接控制有效成分的含量。
4)对有效成分不明确的中药制剂可采用以下方法:
选择可能的有效成分或主要成分(指示性成分)进行含量测定;
测定药物的总固体量;
选择在原料加工炮制时或制备、贮存过
程中易损失、破坏的成分进行含量或限量测定。
5)中药制剂中含有剧毒性成分则要测定其含量。
6)贵重药材在制剂中投料量应加以测定。
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第二章中药制剂定量分析方法
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第一节可见-紫外光谱法
一、单一物质的定量
定量依据是Beer-Lambert定律,A=lC。
测定单一物质时,先测定物质的吸收光
max进行定量分析。
一个物质若有几个吸收峰时,可选择吸收峰较高,在此吸收峰处吸光度随波长变化较小,并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。
一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。
常用定量方法:
1.对照法C样=CA样/A标;
CA样/(AC=样品%,C样和C
标分别为样品浓度和标准品浓度,C
2.标准曲线法:
从标准品吸光度-浓度曲线求得样品浓度。
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二、混合物的含量测定
一)混合物中有a,b两种组分,若两者的最大吸收峰不重合,且在a1max
处,b无吸收;
在b2max处,a1max2max处用单一物质的定
量方法从混合物中测定a、b的浓度。
二)混合物中有a,b两种组分,吸收光谱部分重叠,在a1处,b无吸收;
在b2处,a2处测定总吸收Aa+b1处测定Aa1;
先从Aa
1直接求出a的浓度,根据a的浓度求出Aa2。
再从Aa+b减去Aa2后求得Ab2,就可求得b的浓度。
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(三)双波长测定法
中药制剂分析中常用的方法为等吸收波长法和系数率法。
1.等吸收波长法
1)基本原理
12,其选择原
则
是干扰组分a12处吸收度相等,即
Aa1=Aa2。
而待测组分b12
处的差吸
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A12处测混合
组分
A。
12为测量波长,则
等吸收波长法原理示意图A=Aa+b2-Aa+b1
=(Aa2+Ab
2)-(Aa1+Ab1)
=Ab2-Ab1=b2-b1)CbL
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2)应用举例
喉痛消炎丸中靛蓝、靛玉红的测定
ⅰ)选择等吸收波长:
用2~8g/ml的靛蓝及靛
玉红的氯仿溶液在分光光度计上扫描,并用同
法扫描出空白样品溶液的吸收曲线。
从左图可知靛蓝在540nm、634.4nm处有合适
的等吸收波长;
靛玉红却是在514.2nm和
566nm处有等吸收波长,而空白样品液在上述波长处的吸收曲线几乎成一条直线、不干扰测
图2-1-3
靛蓝、靛玉红的吸收曲线
(1)靛蓝
(2)
靛玉红(3)无青黛样品
s1
=566nm、参比
R1=514.2nms2=540nmR2=634.4nm。
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ⅱ)标准曲线:
精密吸取靛蓝对照品溶液0.25、0.50、、2.0ml;
靛玉红对照品溶液0.20、0.40、、1.40ml,分别放入10ml量瓶中,用氯仿稀释至刻度,分别在上述等吸收波长处测其差吸收度:
A1=A566nm-A514.2nm;
A2=A540nm-A634.4nm;
A对C作标准曲线;
并求出其一元回归方程:
A1=0.02241·
C1(r1=1.0000)
A2=0.04060·
C2+0.0055(r2=1.0000)
ⅲ)含量测定:
精称喉痛消炎丸细粉约0.2g于索氏提取器中,用氯仿提取至无蓝色,
用氯仿定容于50ml量瓶中,再精密吸取5ml置10ml量瓶中,加氯仿至刻度即为样品溶液。
s1R1A样1A1式求出靛蓝的浓度及样品中
s2R2A样2A2式求出靛玉红的浓度及
样品中靛玉红的含量。
2.联立方程法Aa+b1=Aa1+Ab1=a1CaL+b1CbL
Aa+b2=Aa2+Ab2=a2CaL+b
2CbL
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(四)三波长测定法
此法要求在任一吸收曲线上,能找出满足下述条件的三个波长:
即在干扰组分的吸收曲线上,与三个波长相应的点,能在一条直线上。
1.基本原理
123为在任一吸收曲线上,任意
选择的三个波长。
A1、A2、A3为在三个波长处分别测出的吸收度。
根据相似三角形的等比性质,可推导出下式,
A=A2-(mA1+nA3)/(m+n)
={2–(m1+n3)/(m
+n)}CL
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三波长分光光度法的原理说明A与待测组分浓度C成正比。
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2.应用举例
二陈丸中陈皮甙的测定
1)总干扰组分的制备及其吸收光谱
ⅰ)除去陈皮甙后,陈皮其他组分提取液的制备:
用溶剂(含0.1%氢氧化钠的75%乙醇
液)提取陈皮粉,提取液经薄层分离,刮取除陈皮甙以外的所有斑点洗脱,得除陈皮甙以外陈皮其他组分提取液(I)。
ⅱ)二陈丸空白粉提取液的制备:
按处方比例配制除陈皮以外的二陈丸空白粉,用上述溶剂提取,得二陈丸空白粉提取液(Ⅱ)。
将(I)、(Ⅱ)按处方比例混合,得二陈丸总干扰成分液(Ⅲ)。
分光光度计分别测定陈皮甙对照品和(Ⅲ)的吸收光谱。
见左图。
其他成分对
陈皮甙的测定有干扰,用6批不同来源的原料按上法制备(Ⅲ),并测其吸收光谱,结果谱形相似。
可采用三波长法消除干扰。
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2)选择三个测定波长
作图法粗选,再计算精选在(Ⅲ)A=0处,即为精选的三个波长:
λ1=318.0nm,λ
2=286.0nm,λ3=275.0nm。
3)标准曲线配制不同浓度的陈皮甙对照品溶液,在选出的三个波长处,分别测定吸
收度,并算出A值,对A值与浓度C进行直线回归,回归方程为:
A=9.9059C–0.0024(r=0.9990)
4)样品测定精密称取二陈丸细粉约0.1g,加100.0ml上述溶剂浸泡提取15小时,
过滤,取续滤液2.0ml,用溶剂稀释至5.0ml,在选出的三波长处,分别测定吸收度,计算
其A值,再按回归方程算出陈皮甙含量。
本法平均回收率:
98.28%,RSD:
2.12%。
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(五)差示光谱法
差示光谱法的关键有二,其一,提供一个近似理想的参比溶液。
其二,使待测组分发生特征光谱变化,而赋形剂或其他共有组分却不引起光谱变化,因而可消除它们的干扰。
设Ax、Ay分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度,Az代表背景和干
扰组分的吸收度,其不受测定介质改变的影响。
根据吸收度加和性原理,则
A=A样-A参=(Ax+Az)-(Ay+Az)=Ax-Ay
=(εx-εy)CL
差示光谱中的振幅,即最大吸收与最小吸收之差值,也可进行定量测定,这可提高本法的专属性。
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2.应用举例
差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量
1)测定原理胆红素具有高度共轭体系结构,在波长453nm处为最大吸收,在可见光
照射下胆红素易氧化成蓝色产物,在453nm处吸收度显著降低。
2)选用日光下照射30分钟或在红外灯下照射4小时测A值。
3)精密称取胆红素2mg于50ml棕色量瓶中,
加入适量冷(10℃以下)的酸性氯仿(150ml氯
仿中含0.05ml浓盐酸),于冰水浴中超声振
荡20分钟,稀释至刻度,制成储备液。
准确
吸取0,4、0.8、1,2、1.6、2.0ml储备液
于10ml量瓶中,加冷酸性氯仿至刻度,测其
光照前后在453nm处的吸收度。
回归方程
胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱为A=0.0804C+
0.00570(r=0.9995)。
a.光照前b.光照后除光照反应外,其余操作均需避光。
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4)分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液,在453nm处测得各自光
照前后的A值,计算A。
实验表明三种成药A值为零或几乎为零。
说明其他干扰组分在
以上光照条件下不干扰胆红素的测定。
5)精密称取六应丸、六神丸各60mg,牛黄消炎丸120mg置10ml带塞的试管中,准确
加入冷酸性氯仿10ml,冰水浴中振荡20分钟,过滤,弃去初滤液,测续滤液光照前后的A
值,算出A值。
由回归方程算得样品的含量。
本法加样回收率:
六应丸为98.8%,RSD=1.8%;
六神丸为
100.7%,RSD=2.2%;
牛黄消炎丸为93.0%,RSD=1.1%。
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(六)导数光谱法
1
.导数光谱及其特征
通常的吸收光谱,其吸收度是波长的函数
A=C
·
E=C·
?
(λ)。
对波长求导,将其微分系
数(dnA/dλn~λ)对波长扫描可得导数光
谱图。
特征:
(1)
导数光谱的阶数愈高,峰形愈尖锐且数
量亦增多。
(2)
在零阶光谱的极大处,其相应的奇阶光
谱通过零点。
在零阶光谱的两拐点处,奇阶
导数光谱为极大或极小。
(3)
偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似,
零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的极值,
零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。
(4)
导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1。
高斯曲线及其一至四阶导数曲线
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导数分光光度的优点:
a.能检出两个或两个以上的重叠吸收带;
b.能分辨在强吸收曲线“肩部”的弱吸收带;
c.能精密确定单一吸收峰位置;
d.能消除基线(背景)的影响;
e.能进行定量测定。
2.基本原理
吸收光谱服从Beer定律:
A=ε·
C·
L
根据导数光谱的定义,对上式求导,则:
dA/dλ=(dε/dλ)·
CL;
d2A/dλ2=(d2ε/dλ2)·
dnA/dλn=(dnε/dλn)·
式中L为定值,给定物质在特定波长处的dε/dλ、d2ε/dλ2dnε/dλn也是定
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值,因此,dA/dλ∝C,d2A/dλ2∝CdnA/dλn∝C。
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常用的定量参数的选择方法有:
)峰-谷法
测量相邻峰、谷之间的距离。
左图中的h1·
h2(振幅,用D表示)。
2
)基线法
取相邻二同向峰(正或倒)的
公切线为基线,以中间的反向峰峰尖至基线
的距离为测量值。
左图中
p1。
3
)峰-零法
测量峰值到零线间的垂直距
离,左图中p2。
4
)面积法
根据一阶或二阶导数光谱面
导数光谱的测量
积,进行定量测定。
3.共存组分干扰吸收的消除
1)一阶导数光谱法消除线性干扰吸收
A=ελCL+aλ+b
dA/dλ=(dε/dλ)CL+a
说明线性干扰在一阶导数光谱中对定量参数D(振幅)没有影响,D只与待测组分浓度成
正比。
D=(dA/dλ)峰-(dA/dλ)谷
=[(dε/dλ)峰-(dε/dλ)谷]CL
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2)高阶导数光谱法消除非线性干扰吸收及用于重叠峰的分离,定量
若干扰组分吸收对波长呈非线性,为一近似的二次吸收曲线,则总吸收度为
A=ελCL+eλ2+fλ+g
对其求一阶、二阶导数得:
dA/dλ=(dε/dλ)CL+eλ+f
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d2A/dλ2=(d2ε/dλ2)CL+e
4.导数光谱法中的主要参数
1)
微分阶数(n)
n
的选择主要由干扰组分吸收曲线的形状而定。
n越大,分辨力愈
强,但信噪比将降低。
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