番茄ISSRPCR反应体系优化与验证Word文档下载推荐.docx
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优化中图分类号:
S795.9文献标志码:
A论文编号:
cjas15080012基金项目:
福建省自然科学基金项目“利用SSR和SRAP标记构建辣椒遗传图谱”(2014J01115);
福建省农业科技重大专项“茄果类蔬菜新品种选育与种业产业化研究”(2013NZ0002-3)。
第一作者简介:
李永平,女,1974年出生,福建顺昌人,硕士,研究方向:
蔬菜育种。
通信地址:
350003福建省福州市五四路247号福建省农科院高新大楼1711,E-mail:
[emailprotected]。
通讯作者:
康建坂,男,1976年出生,福建永春人,副研究员,硕士,研究方向:
收稿日期:
2015-08-20,修回日期:
2015-11-16。
0引言在生物技术研究领域中,分子技术一直是研究的热点。
ISSR结合了SSR和RAPD的优点,克服了RFLP与RAPD的不足,简单方便,可以检测到更高的种间遗传差异,稳定性也较高[1-3]。
因此,ISSR标记技术被广泛应用于遗传多样性[4-6]、遗传图谱构建[7-8]、种子纯度鉴定[9-10]、植物分类学[11]等研究中,但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响,不同作物最佳反应体系差异较大。
番茄(Lycopersiconesculentum)因果实营养丰富,具特殊风味,是在全世界栽培最普遍的果菜之一,中国各地也普遍种植。
1994年,加拿大蒙特利大学Zietkiewicze等[12]利用了RAPD技术优点和基因组中丰富的SSR序列信息,提出了一种新的分子标记技术(inter-simplesequencerepeat,简单重复间序列,ISSR)。
它可用少量DNA在没有分子生物学研究基础的情况下构建基因组指纹图谱[13-15],由于可同时检测多个SSR座位,重复性好,被广泛应用于遗传多样性[16-19]、种质资源鉴定[12]、分子辅助育种[20]、基因定位[21]、种子纯度鉴定[22-23]、植物分类学[24]等方面。
ISSR标记能补充遗传图谱中一些RFLP标记稀少、间断或空白区,它在QTL定位中也逐渐得到较多的应用[1-2]。
ISSR是基于PCR的分子标记技术,不同植物材料、实验材料及不同扩增条件都将影响其扩增效果[3-4]。
笔者对影响番茄ISSR-PCR反应体系主要因素进行优化实验,旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反应体系,为ISSR技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。
1材料与方法1.1供试材料研究所用材料由福建省农业科学院蔬菜中心提供,体系建立材料为番茄高代自交系T9,验证材料为38个番茄高代自交系。
主要试剂为10×
PCRbuffer(含Mg+,Tiangen公司产),TaqDNA聚合酶(Tiangen公司),dNTP(上海生工生物工程公司产),Mark2000(上海生工生物工程公司产)。
ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.2实验方法1.2.1基因组DNA的提取与检测各番茄品种选取3株健壮、无病虫害、具有本品种特征特性的植株混合取样,每株摘取1~2片幼小、舒展的心叶,用改进的微量CTAB法[5-8]提取DNA。
加入1μLRNase,37℃水浴30min,纯化DNA。
检测各样品的纯度并计算其浓度,将各样品浓度稀释至50ng/μL备用。
用8g/L琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的完整性。
1.2.2ISSR-PCR扩增及产物的电泳分析扩增反应在GeneAmpPCRSystem9600(Applera公司)上进行。
实验采用20μL体系:
2.0mmol/LMgCl2,2.0μL10×
PCR缓冲液,50ng模板DNA,0.3μmol/L引物,0.50mmol/LdNTP,2.0UTaqDNA聚合酶,加入超纯水至20μL。
PCR扩增程序为:
94℃预变性5min;
94℃变性1min,52.2℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;
72℃延伸5min,4℃保存。
PCR扩增产物用15g/L的琼脂糖凝胶在120V稳压电泳50min,EB染色15min,在GDS8000凝胶成像系统(UVP公司)上观察并拍照。
1.2.3ISSR-PCR扩增反应因素筛选及程序调整以番茄高代自交系T9DNA为模板,ISSR引物823,对ISSR扩增反应其中一成分设置梯度进行筛选时,保持其他成分的浓度不变,用双蒸水调节保持总体积不变;
扩增程序中的退火温度设计12个温度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃。
2结果与分析2.1DNA模板浓度对番茄ISSR-PCR的影响DNA模板是影响PCR扩增重要因素,对模板DNA浓度进行优化非常必要。
ISSR-PCR反应中,DNA浓度太低可能无扩增产物,浓度过高则出现非特异性扩增条带甚至会抑制扩增。
反应结果见图1,模板使用量在30~100ng范围内5个不同量的DNA模板均有扩增产物,DNA量在少于50ng时,随着DNA量增加条带逐渐清晰,随后DNA量增加条带清晰度下降,当DNA量增加到100ng时条带就有缺失,50ng时条带最为清晰。
2.2引物用量对番茄ISSR-PCR的影响引物浓度影响引物与DNA模板配对概率,从而影响ISSR-PCR扩增效率。
引物浓度低,与DNA模板结合位点就少,扩增产量就低;
浓度过高,产生非特异性扩增,带型弥散模糊。
引物用量对番茄ISSR扩增的影响结果见图2。
用量为0.1、0.2、0.4、0.5μmol/L时扩增条带比较模糊,用量0.3μmol/L时条带最清晰,因此,最终选用0.3μmol/L为最佳用量。
2.3dNTP浓度对番茄ISSR-PCR的影响dNTP作为PCR反应原料,浓度直接影响反应产量与特异性。
不同浓度的dNTP对番茄ISSR扩增产物的影响结果见图3。
可见实验体系使用的浓度为0.25~0.625mmol/L时随浓度升高,条带清晰度增加,浓度到0.75mmol/L时,条带模糊。
浓度为0.5、0.625mmol/L条带较为清晰,考虑材料的成本,选择dNTP浓度为0.5mmol/L。
2.4TaqDNA聚合酶浓度对番茄ISSR-PCR的影响PCR扩增效果直接受到TaqDNA聚合酶活性和用量影响。
用量过少,酶过早消耗完,产物就少;
用量过多,产生非特异扩增,带型弥散。
5个TaqDNA聚合酶浓度梯度的扩增结果见图4。
浓度为2、2.5U时条带完整清晰,3U时条带弥散模糊,综合考虑扩增效果与成本,选用TaqDNA聚合酶浓度为2U。
2.5退火温度的筛选退火温度对ISSR-PCR反应结果影响很大,实验设计的12个温度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃筛选引物的最佳退火温度(表1)。
实验结果表明,每条引物有其独特的退火温度,23条引物中退火温度最低的为49.0℃,最高的是55.0℃。
各引物的最佳退火温度与TM值之差大多在5℃之内,引物874的最佳退火温度与TM值之差达到9.7℃。
2.6体系的验证引物868对38个番茄高代自交系在50ng模板DNA,0.3μmol/L引物,0.50mmol/LdNTP,2.0UTaqDNA聚合酶,2.0mmol/LMgCl2,2.0μL10PCR缓冲液,加入灭菌的超纯水至20μL的体系,退火温度50.0℃进行ISSR-PCR扩增(图5),表明实验所建立的番茄ISSR-PCR的反应体系扩增效果良好。
2.7番茄ISSR-PCR的反应体系的确立通过实验确立的番茄ISSR-PCR的20μL反应体系为:
2.0μL10×
PCR缓冲液,50ng模板DNA,0.3μmol/L引物,0.50mmol/LdNTP,2.0UTaqDNA聚合酶,加入灭菌的超纯水至20μL。
扩增程序为94℃预变性5min;
94℃变性1min,50℃,退火1min,72℃延伸2min,35个循环;
72℃延伸5min。
各引物退火温度有所差异参照表1。
3讨论在生物技术研究领域中,分子技术一直是研究的热点。
ISSR结合了SSR和RAPD的优点,克服了RFLP与RAPD的不足,简单方便,可以检测到更高的种间遗传差异,稳定性也较高[9-11]。
但ISSR-PCR的扩增效果受物种、反应体系及扩增程序等的影响,不同作物最佳反应体系差异较大。
根据不同物种ISSR-PCR反应最佳体系报道[25-28],引物用量多在0.1~0.8μmol/L,模板DNA在30~100ng,dNTP0.1~0.4mmol/L,TaqDNA聚合酶0.5~1.5U。
本实验TaqDNA聚合酶用量较高,20μL反应体系中TaqDNA聚合酶浓度为2、2.5U时条带完整清晰,dNTP用量也较高,浓度为0.5、0.625mmol/L条带较为清晰,模板DNA、引物用量与大部分研究一致。
笔者研究表明,退火温度是影响实验结果的关键因素,且各引物的最佳退火温度差异较大,23个引物的最佳退火温度在49.0~55.0℃。
ISSR标记使用单引物,长度15~22bp,各引物TM值不同。
林郑和等[29]在建立茶树ISSR-PCR反应体系时发现,退火温度在大于引物TM值2~3.0℃。
何海旺等[30]研究马铃薯ISSRPCR反应体系则认为,不同引物对退火温度的反应规律不同,退火温度较TM值有高有低,但基本都在5℃以内。
笔者的结果与两者的研究均有不同,退火温度与TM值之差最大达到9℃以上。
这可能研究物种与引物序列有关。
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133-137.
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