药理学实验指导22661Word文档格式.docx
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――附表
1、实验动物用注射针头的大小及注射药容量72
2、动物常用麻醉药用法和用量72
3、常用生理溶液成分表73
4、常用实验动物生理参数73
1、药理实验的基本操作技术
一、常见实验动物性别的鉴定
动物
雄性
雌性
大白鼠
与
小白鼠
生殖器与肛门之间的距离较大。
用手指轻捏外生殖器,可见阴茎凸出;
天
热时可见下垂的阴囊。
较小
乳头明显
青蛙
蟾蜍
捏住腰部将之提起时,前肢作环抱状,并
鸣叫。
前肢呈伸直状,
不鸣叫。
前肢拇指与食指间趾蹼上有棕黑色小突起(所谓婚痣)。
无婚痣
家兔
左手抓住颈部皮肤;
右手拉住尾巴,将之夹在中指与无名指
之间,用拇指及食指将靠近生殖器的皮毛扒开。
可见阴茎露出。
仅呈椭圆形间,
无阴茎。
豚鼠
豚鼠无尾,其他同家兔。
二、常用实验动物捉拿法
小白鼠与大白鼠:
右手抓住尾部,将之置于铁丝笼或粗糙的平面上,另一手捏住颈部皮肤,即可将动物捉起。
捉拿大白鼠时可戴软手套。
家兔:
右手抓住耳后颈部皮肤,左手托住臀部。
不可抓双耳将之提起,因兔耳软骨脆弱,不能承受全身重量,易损伤;
且实验时常需耳缘静脉注射给药,抓耳捉拿更应避免。
三、给药方法
1、灌胃法:
小白鼠:
(图1)左手拇指与食指捏住颈部皮肤,将动物背部置于掌心,用同手无名指与小指将尾部紧压在掌心,使颈部与口保持平直。
右手持灌胃器,灌胃管从口角插进口腔,紧沿上腭插入食道。
若通畅未遇阻力,动物安静无呼吸异常,表示已插进食道,即可将药液注入;
若遇阻力,应拔出再插;
若药液误入气管,动物立即死亡。
家兔:
(图5)一人坐定,用大腿夹住兔身,一手紧握前肢,一手固定兔头,使之与颈部呈90度角。
另一人将木制开口器横插进兔嘴,向内翻转,压住舌部。
然后将导管从开口器中央孔插入,直至胃部。
将导管外端放在水中,若连续有气泡逸出,表示导管插入气管内,拔出重插。
无气泡,即可灌药;
灌毕,用少量清水将残留在导管内药液冲进胃中。
2、注射法:
皮下注射:
(图2)注射部位为背部皮下。
注射时,大动物需固定;
小动物用左手小指压住其颈部,用拇指及食指(或中指)将背部皮肤提起。
右手持住注射器,针头略与体表平行刺入皮下,注药,退针要快,以免药液外流。
腹腔注射:
(图3)小白鼠腹腔注射可一人操作,捉拿法与灌胃相同,针头略倾斜约45度自下腹部左或右侧刺入,注药,针头插入不宜太深或太近上腹部,避免刺破内脏,出针也要快。
肌肉注射:
注射部位一般多取后大腿外侧肌处。
将动物固定,左手抓住大腿,右手持注射器,针头与皮肤表面垂直刺入肌肉(小动物斜刺),回抽无回血,即可注药。
静脉注射:
家兔耳缘静脉注射:
(图7)将耳背外缘注射部位毛拔去,用酒精棉球连续擦,使血管扩张。
注射时将血管向心端捏紧,然后进针,刺入后,将针头与兔耳一起捏住,避免针头滑出,注毕退针时,进针处用干棉球按住。
小白鼠尾静脉注射:
将动物固定,暴露尾部,用酒精棉球连续擦尾部(必要时用二甲苯擦,亦可用电灯温烤),使血管扩张。
尾背与左右两侧三根血管皆为静脉,均可选用。
选一扩张较好静脉,左手拇指与中指捏住尾部的近尾端,食指压迫尾根保持血管淤血扩张,(成败关键在于尾静脉是否明显扩张,若不明显扩张,则不易成功)向下弯约45度。
右手持注射器,于弯曲点处成切线方向进针。
推注时遇阻力,且皮下隆起发白,即针头不在血管内,应拔出重新进针。
针头在血管内,推注时不觉阻力。
实验动物用注射针头的大小及注射药容量、动物常用非挥发性麻醉药用法和用量见附表。
四、取血方法
1、小白鼠和大白鼠眼眶后静脉丛取血法:
用左手抓住鼠的颈背部,拇指及中指抓紧头颈部皮肤,食指按在眼睛后,使眼球轻度突出,鼠侧卧位,眼眶球后静脉丛就瘀血。
右手取一蘸过肝素的9号钝针头,沿着内眦眼眶后壁刺入,穿刺时针头应由眼内角向喉头方向前进约4~5mm,轻轻转动再缩回,血液就会流出。
然后用血红蛋白吸管取血(血红蛋白吸管预先用肝素浸润管壁)。
2、兔耳缘静脉取血法:
局部去毛,用电灯照射加热或用酒精或二甲苯棉球涂擦,使静脉扩张,再以石蜡油涂擦耳缘,防止流出血液凝固。
用粗针头将静脉刺破或刀切小口让血自然滴入已放抗凝剂的试管中。
3、兔耳中央动脉采血法:
将兔置于兔固定箱内,由于兔耳动脉遇刺易发生较长时间的痉挛性收缩,因此采血前,必须让兔耳充分充血,力争一次刺中动脉。
为了更好地使耳中动脉舒张,可用麻醉耳神经丛耳支法。
即取1%普鲁卡因溶液2ml注入一侧耳根后下方冠状突与侧突间隙的深层软组织,以麻醉支配耳中动脉的耳神经丛,数秒钟后可见耳动脉充血,指触脉搏感强,证明麻醉成功。
此时即以左手食指与拇指固定中央动脉离心端,针刺部位从中央动脉末端开始,不要在近耳根部取
血,因耳根部软组织厚,血管位置略深,易刺透血管造成皮下出血。
准备好含有1%肝素生理盐水抗凝液的动脉套针,先以12~16号粗针头,在中央动脉末端,沿动脉平行地向心性方向穿过皮肤,然后退出针头,将动脉套针沿刚刺过的孔道刺入动脉,即可见动脉血涌入针管,这时将套针针芯小心抽出,同时将针芯外紧束着的套管送入动脉内,血即自动涌出,此法一次可迅速取血达15ml。
若需连续多次取血,可在套针口连接含有抗凝液的注射器,5分钟左右注射0.5~1.0ml抗凝剂,以免针头处凝血。
或注射0.15ml/kg肝素原液(12500u/2ml)使动物肝素化,以免血液凝固。
五、药物浓度及剂量换算
1、药物浓度:
是指一定量液体或固体制剂中所含主药的份量。
常用以下几种表示法。
百分浓度:
每100毫升(克)溶液所含溶质的克(毫升)数,用符号%表示。
如:
5%氯化钠溶液,即指100毫升溶液中含有氯化钠5克。
比例浓度:
用比例式计算,是指几克(毫升)溶质,制成几毫升溶液,用1:
x比例式表示。
1:
1000肾上腺素溶液,即指1000毫升溶液中含有肾上腺素1克。
克分子浓度(M):
一升溶液中所含溶质的克分子数称为该溶液的克分子浓度。
0.1MNaCl溶液表示1000ml中含NaCl5.844g(NaCl的分子量为58.44g),现均改为摩尔浓度:
1M改为1mol/L。
克当量浓度(N):
一升溶液中含有溶质的克当量数称为该溶液的克当量浓度。
1NH2SO4表示1000ml中含49gH2SO4(H2SO4分子量为98)。
现亦该改为摩尔浓度,凡1价离子者两值相当,如:
1NNaOH=1mol/LNaOH,如2价者:
2NH2SO4=1mol/LH2SO4。
2、剂量换算:
1)动物实验所用药物的剂量,一般按mg/kg(或g/kg)体重计算,应用时须从已知药液浓度换算出相当于每公斤体重应注射的药物量(ml),以便给药。
例:
小白鼠体重18g,腹腔注射盐酸吗啡10mg/kg,药物浓度为0.1%,应注射多少ml?
计算方法:
0.1%的溶液每毫升含药物1毫克,剂量为10mg/kg相当于容积为10ml/kg。
小白鼠常以mg/10g计算,换算成容积时也以ml/10g计算,相当于0.1ml/10g,18g重的小鼠注射0.18ml,如20g体重小鼠,给0.2ml,以此类推。
2)在动物实验中有时须根据药物的剂量及某种动物给药途径的药液容量,然后配制相当的浓度以便于给药。
给兔静注戊巴比妥钠30mg/kg,注射量为1.2ml/kg,应配制戊巴比妥钠的浓度是多少?
30mg/kg相当于1.2ml/kg,因此1.2ml药物应含30mg药物,如要算成百分比浓度1.2:
30=100:
x,x=2500mg=2.5g,即100ml含2.5克,故应配成2.5%的戊巴比妥钠。
2、药理实验设计的基本原则
药理实验是在整体动物或离体器官标本上进行的科学研究,其目的是阐明药物的作用或机制。
在实验过程中,由于各种非处理因素如个体差异、实验条件、仪器设备等均会不同程度影响实验结果,使处理因素(如药物)的效应不容易充分显示出来。
因此,要获得可靠的实验结果,必须精心设计实验,严格遵循实验设计的三大原则:
重复、随机、对照,避免各种误差和偏性干扰,以最经济的人力、物力和时间揭示出处理因素的效应,可达到事半功倍的效果。
一、重复(replication)
重复是实验设计的首要原则,可靠的实验结果,应能在相同的实验条件下重复出来,即重现性。
统计学中显著性检验规定的P值作为评定重现性的尺度,P<
0.05,说明不能重现的概率小于5%,而重现的概率大于95%,即重现性好。
若P<
0.01,说明重现性非常好。
实验的对象即样本大小是保证重现性的基本条件。
为了达到某一重现性,必须有相应的适当的重复数(样本数),样本数过少不行,样本数过大造成不必要浪费,因此应在保证获得可靠结论的前提下,确定最少的样本例数。
样本大小的估计与药效强度、生物的个体差异、对实验正确性要求、P值的大小及统计学处理的方法等因素有关。
药效作用强或两组药效差别大则样本数可小,药效作用弱或两组药效差别小则应增加样本数。
但当两组药效差别很小时,单靠增加例数是不行的,必须用专业知识判别这种微小差别有无实际意义。
大多数生物指标的变异系数在515%之间,如果变异系数小,即该指标稳定,数据稍有变化即有显著意义,则只要很小样本就可得到显著的差别。
如果变异系数大,可使处理后指标的变化被自身变异所遮盖,需要增大样本才能使之区分。
对实验正确性要求可用可信限表示,可信限愈小,对实验正确性要求高,样本应愈大,如可信限大,则样本个体数可较少。
对同一可信限来说,P值愈大,样本愈小,反之亦然。
在上述条件确定的情况下样本数(即需要重复的个体数)可以通过查表获得。
样本大小还与统计处理的方法有关,采用效率高的统计学方法,可以用较少的实验例数取得较好的重现性。
当两组样本数相同时,显著性检验的效率最高。
计量资料的样本数要比计数资料样本数少,每组例数在1030例即可,如多组或多剂量实验,有时每组68例就可统计判断。
而计数资料要大于30例。
同体实验或配对实验、自身前后对比实验效率较高,较少例数即可获得较好统计效果。
某些特殊设计如拉丁方设计、正交设计的效率最高,实验例数可大大减少,而获得信息最多。
除了样本数量外,重复数的质量也是实验能够重现的重要条件。
只有在相同实验条件、相同材料及相同动物模型上进行的实验,所得的结果才能说明结论的可靠正确。
二、随机(randomization)
不论是抽样还是分组,都必须遵守随机化原则。
也就是在抽样时,必须使总体中每一个体都有被抽到机会,这样所抽的样本对总体就会有较好的代表性。
同样,在分组时,必须使每个实验对象都有相同的机会接受分配和处理,这样可消除主观因素或其它偏性误差的影响。
这是实验设计的重要原则之一,具有统计意义和实际意义。
随机化是统计学的基础。
在显著性检验中,通常的无效假设是:
实验结果的差别是非处理因素的作用,即纯系机遇引起,机遇出现的概率就是P。
如果P<
0.05,说明实验结果按机遇情况100次中少于5次,这种情况够少见的,无效假设不能成立,即实验结果非机遇引起,而是由处理因素引起。
所以,无效假设来源于随机过程,是在机遇与处理并存的条件下,使每个个体都有被选中的机会。
避免人为干预,保证了无效假设的基础,提高了显著性检验的灵敏度。
如果实验不是随机进行,即使有系统误差,显著性检验也毫无意义。
在实验中,我们要求各组除处理因素外的其它条件都应完全一致。
实际上在绝大多数实验中是做不到的。
动物的年龄、性别、体重、仪器的性能、实验操作、环境及其它人力无法控制的因素都会影响实验结果的正确性。
随机化是一种最简单、方便、经济的均衡非处理因素的方法,使各组非处理因素基本一致,各组间具有可比性,提高了显著性检验的灵敏度。
随机分组的方法很多,简单的是抛硬币法,按照出现正面或反面的机遇分配。
也可用掷骰子方法,标准的是用随机数字表,使实验对象分组的机会均等。
随机并不是随便,也不是随意。
随机有绝对随机和均衡随机。
绝对随机也称完全随机,把实验动物完全随机分配到各实验组中去,一般用于单因素大样本实验。
此法简单、常用,但效率较差。
在药理实验中,样本例数有限,常采用均衡随机法,将全部动物按性别、年龄、体重及其它条件等分成若干组,每组动物数与拟划分的组数相等,每组内动物的体质条件相似,再给每组的每只动物编号,利用随机数字表把动物分配到各组。
根据划分组数不同,有配对随机、区组随机和拉丁方随机法。
这种方法使易控制的影响实验结果的主要因素如动物性别、体重等在各组均衡一致,比绝对随机优越,应用广泛。
三、对照(control)
对照是药理实验必不可缺的条件。
对照是比较的基础,没有对照就没有比较、没有鉴别。
对照应符合齐同可比的原则。
除了实验处理因素(如药物的种类、剂量、途径等)外,对照组的一切条件(如动物的年龄、性别、体重,实验的时间、环境、仪器、方法、操作人员,对照组的溶剂、容量等),均应与实验组完全一致。
即实验组与对照组应做到四同:
同时、同地、同批动物和同条件。
这样才具有齐同可比性,突出处理因素的效果,才能得出准确的结论。
在药理实验中,对照组的类型很多,有阴性对照或空白对照(对照组给同量生理盐水)、阳性对照或标准药对照(采用药典收载的或疗效确切的药物对照)和模型对照(对照组制作病理模型)等。
对照组的例数应与实验组相等,这样统计效率最高。
对照组一方面起对照作用,同时又起监控实验条件的作用,这样保证了实验的可靠性。
3、数理统计在药理学实验中的应用
一、数理统计的几个基本概念
1、总体、样本与抽样
“总体”是指同质的研究对象所构成的集体。
例如研究的是宫颈癌,总体应是全部宫颈癌患者,不能把患其它病的病人也纳入其中。
总体中个体数目的多少要视研究范围而定。
例如,研究某药对乙型肝炎的疗效,总体就是全部乙型肝炎患者。
假如研究的是对迁延性乙型肝炎的疗效,总体就是全部迁延性乙型肝炎患者,比前面的就小了。
在科学研究中,由于种种原因,不能将总体中的每一个体都加以观察,而只能抽取总体中的一部分作为直接研究的对象,这就是样本。
药理实验中所用的样本都是小样本。
从总体中抽取样本的过程称为抽样。
由于总体中各个体存在变异,各样本均数(或率)会各不相同,与总体的均数(或率)也会有差异。
这种由抽样而引起的差异称为“抽样误差”。
抽样误差是不可避免的客观规律。
一般说,样本愈大,抽样误差就愈小,和总体情况也就愈接近。
但是,在实际工作中,往往不可能观察太多的个体,只能从较小的样本所得的资料来分析、推论总体。
这就要求样本在质量上对总体有较好的代表性,并具有一定数量,尽量减少抽样误差。
2、显著性检验
显著性检验的意义可举一例子说明。
在观察抗凝血药对心肌梗塞死亡率的影响的某一试验中,有二组病人,一组用了抗凝血药,该组病人的死亡百分率为25%,另一组未用药作为对照,其死亡率为41%,问抗凝血药是否可以降低心肌梗塞病人的死亡率?
在这一研究样本所得的实验结果中,抗凝血药组的死亡率小于对照组,但是这种结果是否可以推论总体,究竟是总体的真实反映(二组的死亡率确实有差异)还是纯属机遇(即碰巧)所发生的?
这种探究机遇引起的两组疗效的差异超过实际由两个不同总体引起差异的概率有多大,这必须经过统计学中显著性检验。
显著性检验的步骤可分为三步:
1)提出“无效假设”H0,即两组数据均来自同一总体,其差别是由于抽样误差所引起。
在上述例子中,无效假设是“抗凝血药并不能降低心肌梗塞病人的死亡率,两组病人均接受相同死亡率支配,实际死亡率的差别纯系机遇所造成”。
2)根据总体抽样的规律,可由两组样本的实测数据计算出“无效假设”的可能性(概率)有多大,通常用大写的“P”表示。
3)如果P<
0.05或0.01,说明两组间纯属按机遇所发生的概率100次中不到5次或1次,这种可能性很小,因而否定“无效假设”。
即两组样本来自同一总体的可能性很小,它们的差别在统计学上有显著或极显著意义。
反之,如果P>
0.05,说明两组机遇概率大于5%,即来自同一总体的概率大于5%,这时不能轻易否定“无效假设”,尽管两组间有差别,但这种差别无统计学意义。
值得注意的是统计学结论的意义并不等于专业结论的意义,两组差异有统计学的显著、极显著或无显著意义并不说明两组均数(或率)的差别大、很大或不大。
统计学上差异非常显著时,在专业上未必就有显著意义。
例如某种药物用药前后舒张压平均下降1.3kPa,经t值检验,P<
0.05并得出“用药前后的差值均数有显著意义”的统计学结论,但并不意味着该药就有“显著疗效”或临床应用价值。
显著性水平及统计学意义
判断标准
统计结论
注意
P≤0.01
差别有极显著意义
不等于差别极大
P≤0.05
差别有显著意义
不等于差别大
P>
0.05
差别无显著意义
不等于没有差别
二、定量资料的统计分析
定量资料又称计量资料。
是研究量反应即测量试验对象某项目指标数值大小所得的资料。
如身高、体重、心率、血压等是最为常用的资料类型。
资料获得后,应分析其性质、分布等,才能选择适宜的方法进行统计分析。
1、计量资料的代表性参数
1)均数(算术平均数x)
均数是用来描述一组定量数据(符合正态分布)集中特征的统计学参数。
均数与例数的乘积应等于各观察值的和,各观察值与均数差值之和为0,即(x-x)=0。
各观察值与均数差值的平方和即(x-x)2为最小。
2)标准差(s)
标准差是反映一组定量数据离散程度的参数。
s大,表示观察值分散。
实际应用中,常以均数标准差(xs)综合表达一组数据集中和离散特性。
一般来说,该组数据中约有2/3的观察值在xs范围内,约有95%的观察值在x2s范围内。
由此可了解数据的大致分布。
3)标准误(SE,Sx)
标准误表示抽样误差的大小,是反映均数可靠性的参数。
标准误小,说明抽样误差较小,样本均数与总体均数较接近,用样本均数代表总体均数的可靠性大;
反之,标准误差越大则表示样本均数越不可靠。
样本均数的可靠程度可用均数±
标准误的范围来估计。
在xSx范围内,总体均数出现的概率约为68%,也就是说在重复的100次实验中,约有68次实验的均数在该范围内,因此Sx越小,由样本均数估计总体均数的误差范围也越小,均数可信性也越好。
标准差和标准误不同,前者表示各个测量值的离散程度,而后者则说明样本均数的抽样误差,即样本均数对总体均数的离散程度,所以标准误可称为“样本均数的标准差”。
4)可信限
可信限是由样本均数估计总体均数所在可信范围的数值。
95%可信限=x-t0.05SEx+t0.05SE,99%可信限=x-t0.01SEx+t0.01SE,根据自由度(df=n-1)查t值表,查出t0.05及t0.01值再按公式计算而得,其中95%可信限最为常用。
2、配对比较的t检验
配对t检验是最常用的同体比较的显著性检验,适用于同一实验对象用药前后的比较,也可用于实验对象(同窝、同种)按年龄、体重和性别等进行配对后随机分为实验组和对照组,对每对动物的观察值的差值进行显著性检验。
该检验的效率较高。
d为差值的均数,s为差值标准差
用Casiofx-180p计算器操作:
Mode3,INVKAC,输入第一对差值d1按DATA
输入第二对差值d2按DATA
输入第三对差值d3按DATA
输入第n对差值dn按DATA
INVxKo3INV¯
INVXn-1=(t值)
根据自由度(df=n-1)查t值表,检验用药前后差别是否显著。
3、成组比较的t检验
由于常常很难找到条件相同的个体来配对比较,可把动物随机分成两组,各施以不同处理,算出各组均数,然后进行均数比较,这就是团体t检验。
适用于独立分组的定量数据的比较。
根据自由度df=n1+n2-2查t值表,确定P值。
1)当两样本数不等(n1n2)时:
ModeINVKACINVMin
s1(n11)INV¯
M+
s2(n21)INV¯
x1x2=INVX2MR
n1n2(n1+n2)(N-2)=INV¯
(t值)
例题:
在某一药理实验中,测得的数据如下:
第1组:
n1=5,x1=10.16,s1=1.14
第2组:
n2=6,x2=9.92,s2
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