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若水样碱度大,加入乙酸调节样品pH到5后过滤:
在需要对一氯乙酸和一溴乙酸进行定量分析时,若水样的硝酸根、硫酸根、碳酸根等浓度较高时,可能导致一氯乙酸和一溴乙酸基质效应明显,则过滤后按1:
100比例加入4mg/L混合内标工作液,样品中含两种内标浓度均为40μg/L。
1.1.6测定
1.1.6.1液相色谱条件
1.1.6.1.1流动相A:
乙腈,B:
含0.05%乙酸的超纯水,参考梯度条件见附录B
1.1.6.1.2流速:
0.4mL/min
1.1.6.1.3柱温:
30℃
1.1.6.1.4进样量:
10μL
1.1.6.2质谱条件
1.1.6.2.1电离源:
电喷雾负离子模式
1.1.6.2.2毛细管电压:
3.5kV
1.1.6.2.3源温度:
120℃
1.1.6.2.4脱溶剂气温度:
350℃
1.1.6.2.5脱溶剂气流量:
800L/h
1.1.6.2.6碰撞室压力:
3.0×
10-3mbar
1.1.6.2.7卤乙酸及内标特征离子见附录C
1.1.6.3测定将处理好的样品按照仪器分析条件进行测定
1.1.6.4平行试验将同一样品按相同步骤进行测定
1.1.7数据处理及结果表达
每次测定前配制标准系列(3.10),按浓度由小到大的顺序,依次上机测定,得到目标物浓度与峰面积比的标准曲线。
标准溶液的液相色谱-质谱/质谱多色谱图参见附录D。
液相色谱-串联质谱测定采用标准曲线法定量,即用各组分的浓度和子离子峰面积绘制标准曲线,通过样品的峰面积查询所得的浓度就得到样品的浓度,浓度都以μg/L为单位。
当采用同位素内标法对一氯乙酸和一溴乙酸进行定量分析时,其浓度按下列公式计算。
………………………………………..
(1)
式中:
C样品中某卤乙酸的浓度,μg/L
A某卤乙酸对应的子离子峰面积
Cis样品中某卤乙酸对应的内标浓度,μg/L
Ais样品中某卤乙酸对应的子离子峰面积
1.1.8精密度
在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
1.1.9注意事项
每次测试前新配标样做标准曲线,至少每20个样品中间插一个质控样,以确定仪器状态和是否需要重新绘制标准曲线。
每批样品同时需要做实际水样加标回收实验,实际水样加标100μg/L回收率应介于70%~120%之间。
若加标回收率不在此范围,则需要做校正曲线或用同位素内标稀释法定量。
若发现实际样品各组分保留时间和标准样品偏离较大,则需调节样品的pH值到5左右。
附录
附录A卤乙酸及同位素内标的英文名称、缩写及CAS号
卤乙酸
英文名
缩写
CAS号
一氯乙酸
monochloroaceticacid
MCAA
79-11-8
一溴乙酸
monobromoaceticacid
MBAA
79-08-3
二氯乙酸
dichloroaceticacid
DCAA
79-43-6
一氯一溴乙酸
bromochloroaceticacid
BCAA
5589-96-8
二溴乙酸
dibromoaceticacid
DBAA
631-64-1
三氯乙酸
trichloroaceticacid
TCAA
76-03-9
一溴二氯乙酸
bromodichloroaceticacid
BDCAA
71133-14-7
一氯二溴乙酸
dibromochloroaceticacid
CDBAA
2578-95-5
三溴乙酸
tribromoaceticacid
TBAA
75-96-7
一氯乙酸-d3
monochloroaceticacid-d3
MCAA-d3
1796-85-6
一溴乙酸-d3
monobromoaceticacid-d3
MBAA-d3
14341-48-1
附录B流动相梯度
时间(min)
流动相A
流动相B
初始
40
60
3
3.1
100
3.5
4.5
注意:
此条件为超高效(压)液相色谱的参考条件,普通高效液相色谱需要根据实际情况进行延长时间。
附录C九种卤乙酸的ESI-MS/MS质量条件参数
母离子
(m/z)
子离子
锥孔电压
(V)
碰撞能
(eV)
92.9
35.0
20
10
136.9
78.9
11
126.9
82.9
22
172.9
128.9
9
216.8
172.8
160.8
116.8
15
7
206.8
162.8
18
8
250.8
30
94.9
138.9
附录D标准样品参考色谱图
《二氯乙酸等卤乙酸液相色谱-串联质谱法》
编制说明
一、任务来源
根据我院承担的住房和城乡建设部2011年下达的《城市供水水质检验方法标准》修订合同(2011-3-7)及“水体污染控制与治理”重大专项课题《水质监测关键技术及标准化研究与示范(2008ZX07420-001)》的任务要求,我院组织有关人员进行了深入研究和实验室验证实验建立了适用于城市供水行业的卤乙酸—液相色谱-串联质谱法,并经北京市自来水集团水质监测中心,深圳水务集团水水质监测中心,广州自来水集团水质监测中心,武汉水务集团水质监测中心,北京市疾病预防控制中心等5家单位进行了协同验证试验,本方法的各项技术指标均达到消毒副产物卤乙酸检测的要求。
二、编制依据
1.水质指标概述
卤乙酸为乙酸甲基上的三个氢被氯、溴等卤素原子取代的氯消毒副产物,可引起DNA损伤,导致遗传毒性,是饮用水监测中被广泛关注的消毒副产物。
《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)中规定:
二氯乙酸和三氯乙酸分别不得超过50μg/L和100μg/L;
世界卫生组织(WHO)2011年第四版的《Guidelinesfordrinking-waterquality》中一氯乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸的推荐限值分别为:
20μg/L、50μg/L、200μg/L;
美国EPA则规定一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙酸的总和不超过60μg/L。
2.国内外相关分析方法的研究现状
在液相色谱串联质谱技术广泛应用之前,卤乙酸的分析方法有三类:
1)衍生、气相色谱或气相色谱质谱法,如EPA552.1及552.2,国标《GB/T5750.10-2006生活饮用水标准检验方法消毒副产物指标》,该方法需要进行衍生化,操作复杂,耗时长;
2)离子色谱法,不需要前处理,但容易被氯离子,硫酸根离子等干扰;
3)毛细管电泳法,需要添加表面活性剂,由于仪器普及率低,所以不宜推广。
最近,Chen等人采用了HILIC色谱柱,建立了九种卤乙酸的超高效液相色谱/串联质谱检测方法,其检测限达到了0.08–2.73μg/L,但其要求水样用9倍的乙腈稀释,且分离差;
Meng等人采用了BEHC8柱,也建立了九种卤乙酸的超高效液相色谱/串联质谱检测方法,可以直接进水样,检出限达到0.16-8.87μg/L,且分离较好,但有几种卤乙酸的保留不理想。
3.方法制定的意义和目标
本方法可直接进水样,不需要衍生化和富集、简便快速、检测限低,灵敏度高,可用于饮用水中卤乙酸的检测,为日常监测和饮用水卤乙酸处理及健康风险评价提供基础。
三、实验条件的选择
1.色谱柱条件的优化
前文提到的文献中已经使用了HILIC、C8、T3、C18进行测试,最近出现的表面带电杂化颗粒(ChargeSurfaceHybride)色谱柱,增加了分离能力。
本研究只选用了CSH系列的两种色谱柱(氟苯基,C18)进行比较,其中的CSH氟苯基柱(CSHFluoro-Phenyl)为三键键合的C6链连接五氟取代的苯基,其对带卤素原子取代的极性物质有很好的保留性,也会提高灵敏度和检测限。
实验发现CSHC18柱能很好的分离9种卤乙酸,相邻组分保留时间差都大于0.1min,但响应值较低,只有氟苯基柱的10~50%左右;
氟苯基柱的灵敏度和保留性明显提高,分离度稍差,但两级质谱对分离要求不高。
氟苯基色谱柱在低pH值时对氯乙酸保留非常强,经过优化选择含0.005%乙酸的水和乙腈作为流动相,得到最佳的灵敏度,但由于自来水都具有碱度、流动相的乙酸会被中和,且卤乙酸在CSH氟苯基柱中的分离对pH值敏感,导致保留时间偏移较大,因此不予采用。
0.1%的甲酸水溶液和乙腈作为流动相,保留时间偏移很小,但灵敏度大幅降低。
0.05%乙酸的水和乙腈作为流动相,灵敏度稍微降低,但分离度提高,实际样品的保留时间偏移很小。
图1不同样品的实际检测色谱图
优化后空白样品(blank)、40μg/L标品(40ppb),自来水样(tapwater),自来水加标40μg/L样品(tap40)的色谱图见图1。
由于九种卤乙酸只是取代卤素原子数量和组成的差别,含有单个卤素原子的一氯乙酸和一溴乙酸最先出峰,然后是两个卤素原子二氯乙酸、一氯一溴乙酸、二溴乙酸,最后是含三个卤素原子的三氯乙酸、一溴二氯乙酸、一氯二溴乙酸,三溴乙酸。
自来水样品的保留时间与标样相差都小于0.06min,均为提前,这是因为CSH氟苯基柱对卤乙酸的保留性随pH值降低而增强,而自来水样品的pH值大于7,使得pH升高。
优化后确定流动相A:
含0.05%乙酸的超纯水,使用前超声脱气10min,流动相B:
乙腈,流速为0.4mL/min,柱温30℃。
标准样品直接进样,自来水样品加入抗坏血酸(20mg/L)后过滤再进样或进行加标进样,进样量均为10μl(也可加大到20μl降低检测限)。
值得注意的是,卤乙酸的分离受pH值影响,自来水的pH值一般在7左右,若水样的pH值偏高或碱度较大,可能导致实际水样的各组分保留时间提前,可以用乙酸调节样品pH值到5左右后再加抗坏血酸过滤进样。
洗针液用10%乙腈(弱洗)和90%乙腈(强洗)。
表1流动相梯度
变化曲线
6
1
2.质谱条件优化
对于离子的质量参数,由于氯有Cl35和Cl37两种同位素(天然丰度为75.47%和24.53%),溴也有Br79和Br81两种同位素(天然丰度为50.69%和49.31%),需要考虑同位素峰。
因此,除了用Masslynx软件的IntelliStart功能进行自动寻找母离子和子离子,优化锥孔电压和碰撞能之外,对含溴的卤乙酸要选择相应值最高且稳定的离子碎片。
如三溴乙酸通过Masslynx软件自动优化质谱条件的结果:
母离子m/z248.85,子离子m/z78.98,。
而实际扫描发现母离子m/z250.8响应值更高,综合参考文献选择m/z250.8作为母离子。
由于卤乙酸结构简单,很难找到两个合适的子离子碎片,因此都只选用了一个离子对进行检测。
一氯乙酸选择氯作为子离子,一溴乙酸和三溴乙酸选择溴作为子离子,其他离子为[M-H]-或[M-COOH]-。
参考的质谱条件:
ESI负离子模式,毛细管电压3.5kV,离子源温度120℃,脱溶剂温度350℃,脱溶剂气800L/h,锥孔气50L/h,碰撞气0.17ml/min,即保持碰撞室(CollisionCellMKS)压力数值在3.0e-3mbar左右,根据实际数值进行调整。
RFlens0.1V,LMResolution均为13,IonEnergy1.0,九种卤乙酸对应的质量条件参数见表2。
表2九种卤乙酸的ESI-MS/MS质量条件参数
3.样品基质效应的消除
电喷雾电离离子源(ESI)容易受样品基质的影响。
试验中发现,若水样的硬度较大,硝酸根、硫酸根、碳酸根等浓度较高时,可能导致一氯乙酸和一溴乙酸基质抑制效应明显。
为消除样品基质效应,我们采用内标法定量,从而消除了样品基质效应。
一氯乙酸和一溴乙酸对应的内标分别为一氯乙酸-d3和一溴乙酸-d3。
四、标准曲线
九种卤乙酸的标准曲线参数见表2,除最后出峰的三种卤乙酸外,其它六种从0.2μg/L~400μg/L都有很好的线性相关性,相关系数R2都大于0.999。
根据相关文献,卤乙酸检出频率较高的为含氯的卤乙酸,浓度一般在10μg/L数量级,很少有超过国家标准的报道。
因此选择的标线范围从0.2μg/L~400μg/L,且加密了100μg/L以下点的设置,能更好的满足实际检测需要。
标准曲线采用强制过零点的线性拟合。
高浓度样品的偏离百分比一般都小于10%,低浓度接近检测限的样品偏离百分比较大,但最大也在30%以下。
由于九种卤乙酸的分子量和离子化程度差异较大,标准曲线的斜率差异很大,峰面积对浓度的斜率最小的为三溴乙酸1.128,最大的是二氯乙酸的319.74,本方法开发的时候采用的是等浓度的九种卤乙酸混标,若用单标配制,可根据标准曲线的斜率调整不同卤乙酸组分的浓度。
也可以根据当地水样的检测结果调整标线的范围。
表3九种卤乙酸的标准曲线
保留时间(min)
R2
线性范围μg/L
1.88
0.9986
5~400
1.90
0.9999
1~400
2.66
0.9998
0.2~400
2.73
2.82
0.9997
3.06
0.9995
3.11
0.9994
3.16
3.20
0.9996
五、方法检出限
信噪比是常用的一种来评价检测限的方法,信噪比(S/N)3为检出限(LOD),10为定量限(LOQ)。
根据信噪比法估算的检测限选取检测限浓度3-4倍的样品重复测定7次,计算出标准溶液重复测定7次的标准偏差(SD)=0.002870;
按照公式MDL=SD×
t(n-1,1-α=0.99)进行计算。
式中n=样品重复测量的次数,SD为n次测量的标准偏差,t为自由度n-1时的t分布值,1-α为置信水平。
若重复测定7次,置信水平为99%,查t值则可简化为MDL=3.14SD。
表4九种卤乙酸的方法检测限
标样
μg/L
实测浓度μg/L
MDL
2
4
5
SD
1.54
1.23
1.38
1.69
0.17
0.55
1.24
1.07
1.36
1.12
1.01
0.12
0.39
1.44
1.22
1.39
1.25
1.27
0.08
0.25
1.33
1.32
1.16
1.08
1.20
1.05
1.15
0.11
0.34
1.19
1.13
1.11
1.06
1.18
1.14
0.05
0.14
6.15
6.43
6.57
5.87
6.71
6.01
11.33
10.86
9.92
14.17
10.15
9.68
1.52
4.76
13.27
12.39
9.73
10.62
11.50
1.53
4.81
10.54
9.46
8.82
9.03
9.25
0.69
2.17
六、精密度
低浓度样品的可重复性在检测限计算时(表4)已经有体现,选取100μg/L(二氯乙酸国标限值)和40μg/L(接近三氯乙酸国标限制50μg/L)的样品重复测定7次评价其标准偏差。
结果见表5和表6。
表5100μg/L样品7次测定结果
RSD
102.19
101.56
102.87
103.87
102.59
99.50
108.75
2.77
101.31
100.48
102.54
101.08
102.77
98.70
106.75
2.47
104.96
103.91
104.27
103.36
103.13
102.57
105.64
1.03
107.54
108.08
109.55
107.81
107.04
101.13
114.49
3.64
101.19
100.91
100.58
101.25
99.28
92.49
106.23
4.06
100.11
99.52
107.47
105.19
101.50
101.96
105.18
2.89
102.11
102.33
109.95
102.20
101.61
107.69
112.69
4.31
96.25
100.88
99.48
99.39
100.04
105.71
107.62
3.90
99.20
104.29
108.99
99.42
100.99
97.85
108.60
4.47
表640μg/L样品7次测定结果
40.88
40.65
42.75
41.69
41.39
44.46
42.86
41.38
41.25
43.54
42.00
42.89
43.85
37.86
5.17
44.38
43.15
46.13
45.13
45.50
42.62
43.57
7.08
45.75
43.90
44.95
44.72
43.70
43.08
44.29
4.14
43.88
43.35
44.84
44.35
43.51
40.46
41.07
6.19
43.25
44.01
43.45
43.81
36.43
6.67
一溴
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