STR常见问题Word格式.docx
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STR常见问题Word格式.docx
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1、应用重复单位较长的STR标记(四、五碱基重复);
2、含有不完全重复单位的STR等位基因(TH019.3);
3、选用扩增活性强的DNA聚合酶(如C-Taq酶);
4、优化扩增条件。
补充:
为什么一个基因座Pannel下出现3个扩增峰?
1
样本本身即为三带
②其他荧光引起的Pull-up峰
③两个等位基因的Stutter峰恰好重叠,导致Stutter峰叠加偏高
二、非模板添加(+A不全或-A峰)
1、产生机制
DNA聚合酶在复制模板链时在PCR产物的3`末端添加一个额外的腺苷酸(+A),故PCR产物比实际靶序列长一个碱基,而当酶在DNA复制过程中没有在所有复制链上添加腺苷酸,则产生-A峰。
2、表现状态
3、解决方法
1)在非标记引物5’端添加特殊“尾巴”(e.g.,GorGTTCTT)详细翻阅法医DNA分型第六章
2)提高终延伸温度(1℃左右)或增加终延伸时间(e.g.,15-45minat60or72℃)
3)调整模板DNA浓度至最适宜范围(e.g.,0.5~2.0ng),一般为降低模板浓度
4)换用高质量的Taq酶(e.g.,AGCUC-Taq热启动酶)
三、微变异
1、定义
含有某种序列变异的等位基因被称为微变异,因为它们与完全重复的等位基因仅有细微的差别。
例TH01:
9.3的重复区包括9个完全重复单位(AATG)和一个三核苷酸的不完全重复的时候,丢失了一个碱基。
等位基因9.3和10的区别是在第七个重复单位有一个腺嘌呤碱基的缺失。
AATG—AATG—AATG—……AATG—AATG—AATG—AATG—AATG
2、确认微变异
1)先确定该OL峰并非扩增或电泳引起的杂峰
2)使用其他试剂盒重新验证
3)有条件可以做测序验证
4)与已报道过的微变异进行比较并记录在案http:
//www.cstl.nist.gov/strbase/var_tab.htm
稀有等位基因
1、稀有等位基因的相关概念:
①稀有等位基因与常见的等位基因相差一个或一个以上的碱基
②STR等位基因的序列变异可以是插入,缺失或者核苷酸改变
③与常见等位基因比较,含有某种序列变异的等位基因称为微变异,因为它们与完全重复的等位基因仅有细微的差别。
在STR遗传标记中常见的微变异的例子是THO19.3
④三带会出现两种情况
4.1三个峰带型在强度上基本相同
4.2三个峰带型在强度上出现不均衡现象
(这种特殊的峰并不是混合物的产物,而是样本的复制假象)
2、常见稀有基因:
D13S317Bin外
D7S8209.19.310.111.112.1
Penta.E17.418.419.420.421.4Bin外
D6S104312.317.318.219.320.322.3Bin外
D21S1130.130.3
FGA因引物设计问题,Bin进入D5(ABI/Promega)
CSF因引物设计问题,Bin进入D19(与FGA情况一致)
知识点分享:
1、VWA出现14号等位基因时,如果是杂合子则易出现不均衡现象(14号较高)。
2、PE出现5号等位基因时,如果是杂合子且两峰相离较远时则易出现不均衡。
四、拔起峰(Pullup)
1、拔起峰从何而来
Matrix文件通过包含每种颜色的样本的电泳而建立,各种颜色的电泳结果组合成一种数学矩阵,以消除与其他颜色光谱重叠的部分,每一种荧光染料都有不同波长的最大发射光谱,而当某一荧光染料过多造成matrix去颜色叠加不能正常工作,会发生“拔起”(Pullup)的现象。
拔起是由于颜色从一个光谱通道扩散到另一个的结果,通常由于超高峰的原因。
详细翻阅法医DNA分型第13章
2、表现状态
3、原因及解决方法
引起的原因
减少的方法
DNA模板量过多
重新扩增减少模板DNA加样量
扩增循环数过多
重新扩增减少扩增循环数
上样量过多
电泳检测时减少PCR产物加样量
多种电泳问题
电泳检测时减少进样时间或电压
重建光谱校正
维护仪器,跟换毛细管、激光管、CCD
何为Matrix?
Matrix的作用是什么?
一:
Matrix(ABI3100中称为光谱校准)为电泳时不同颜色的分离标准。
如果不能确定峰的颜色,则不能正确判读此样本的基因分型。
Matrix在稳定的环境条件下是相当精确的。
二:
每种荧光染料都有不同波长的最大发射光谱,被用来分离各种颜色的滤光片显示在四种染料光谱中央。
在滤光片波长范围内可明显观察到这几种染料的重叠。
FAM和HEX之间的重叠程度尤其高。
这种重叠影响到发生在两种染料检测通道间易引起Pull-up。
五、无效等位基因
如果DNA模板的PCR引物结合区发生单碱基突变,就会阻碍引物的结合,导致扩增失败,称为无效等位基因。
DNA模板的正向引物结合区,发生碱基突变
六、出峰延迟及出峰提前
出峰提前出峰延迟
出峰延迟的原因
解决的方法
出峰提前的原因
电泳迁移率变慢
电泳迁移率变快
Buffer长时间不换,缓冲能力变差
及时更换Buffer
胶过期或室温放置时间过长
保证胶的质量,Pop胶放置在仪器上不要超过1周
胶过期或室温放置时间过长,Pop胶的类型与仪器不匹配,如Pop-7
Oven温度过低
设定Oven温度为60摄氏度
Oven温度过高
室内环境温度过低
控制环境温度在22摄氏度左右
室内环境温度过高
七、变性不全(二级结构)
变性过程中温度升到一定高度,双链分开,形成单链。
温度快速下降保持单链状态,(eg.95℃~-20℃)如果慢慢降温,单链则开始重新配对,配对过程中发生错配因而导致二级结构。
2、表现形态
1)样品电泳前进行变性处理:
95℃加热3min,立即冰浴3min
2)使用高质量的去离子甲酰胺,-20℃分装保存;
勿使用过期变质的胶
八、电泳基线
电泳基线即为电泳自身发射出的线谱。
(机器稳定性的判别点)
非正常电泳基线正常电泳基线
1、电泳基线不平原因:
主要原因是电泳系统中存在荧光物质干扰
2、电泳基线不平解决方法:
1)及时更换水和Buffer
2)WaterWash冲洗Block(胶块)
3)更换胶、更换毛细管
4)养成良好的仪器维护习惯,保持电泳系统干净
九、数据分析时出现OffLadder峰
现象
原因
解决方法
a.所有基因座均为OL峰
a.电泳时未加Ladder或分析时忘记选择SampleType或Ladder中内标迁移率与样品中内标迁移率差别过大
a.加Ladder重新电泳;
分析时改回“Ladder”重新分析
b.小片段基因座正常,大片段基因座出现OL峰
b.内标定义不完全
b.手动更改设置,将后面的siz添上去
c.个别基因座出现OL峰
c.Ladder电泳质量差;
干扰峰影响Ladder正常分型
c.删除不好的Ladder或重新电泳(如果是拔起峰干扰,降低上样量或减少进样时间和进样电压后重新电泳)
d.正常的OL峰
d.微变异
d.通过与Ladder或相应的siz值计算其峰值
十、
峰型前高后低
1、查看SIZ,确认是电泳问题
解决办法
•Buffer长时间不换,缓冲能力变差
•胶块或连接管中有气泡
•毛细管堵塞
•毛细管使用次数过多(3730600runs)
•及时跟换阴、阳极Buffer
•每天都应检查胶块或连接管中有无气泡,及时排除
•FillArray(填充)数次、空跑甲酰胺或去离子水
•更换毛细管
(周末或节假日关机前,用去离子水或甲酰胺电泳1~2run,以清洗毛细管中残留的杂质,延长毛细管使用寿命。
)
1、不是电泳问题,是样本问题
•PCR抑制物太多
•DNA降解
•纯化模板
十一、检测峰太强和检测峰太弱
2、检测峰太强
检测峰过强会导致
Pullup峰
前高后低
无法正确分型或分型错误
个别基因座扩增不平衡
模板量过多
扩增循环数过多
加样量过多
进样量过多
调整模板量至最适范围
减少扩增循环数
减少加样量、进样时间或/和进样电压
3、检测峰太弱
实验版:
模板量浓度过低
扩增循环数过少
加样量过少
进样量过少
PCR抑制物过多
DNA降解
增加扩增循环数
增加加样量、进样时间或/和进样电压
纯化模板
专家版:
模板DNA不纯
重新纯化
模板DNA量不足
增加模板用量
模板DNA量太多
减少模板用量
酶活性不足
换用高质量的Taq酶
扩增程序不正确
查看并选择正确的扩增程序
高盐浓度或pH改变
样本中过多的钾、钠、镁离子或EDTA可影响PCR
热循环仪或PCR管有问题
选择高质量高规格的仪器和耗材
引物浓度太低
用推荐的体系进行扩增
毛细电泳进样差
换用新的毛细管
打孔时如何控制模板量?
①新鲜血样:
较浅血样,挑选颜色较深且双面均有血斑处打孔。
较深血样,挑选单面血斑处打孔,如正反面均有血斑,则在血斑与滤纸间打孔(血斑占滤纸的2/3左右)
②1~2年血样,挑选双面血斑处打孔。
③陈旧血样,挑选颜色较深且双面均有血斑处打孔,如扩增效果不佳,则选用1%TritonX-100浸泡10min~30min,烘干。
血红素较多(近期采集的血样),抑制PCR反应如何处理?
①将血滤纸片用扩增仪或烘箱烘95℃15~30min,其作用是将新鲜血样变为陈旧血样,效果得到明显改善。
②水洗(此方法不常用,改善效果不明显)
十二、荧光脱落
标记在引物上的荧光素与引物间的链接断裂,荧光素残基聚集形成大分子聚合物,电泳检测时则表现为某一种颜色中在一个固定的位置出现了一个不是扩增产物的峰。
FAM:
123-127bp;
HEX:
170bp
1、表现状态
2、形成原因(理解版)
1)引物未优化:
荧光素引物未能完全匹配结合,但又未经优化,若有多余的荧光素,形成荧光脱落
2)在DNA复制过程中,荧光素一小部分与引物脱离,形成荧光脱落。
(很多脱落的小荧光素会聚集在一起,电泳检测时形成明显的荧光脱落)
十三、补充知识点
1、迁移率
AL迁移率与样本内标迁移率有区别的原因:
当电泳环境不稳定或不佳时,AL内标迁移率与样本内标迁移率有区别。
2、—A峰为什么要在非标记引物5”端添加尾巴“G"
或“GTTCTT”
促使聚合酶在所有模板链上都能加“A”
3、样本中VWA有非特异性峰14#
因为在引物设计时,并未在模板库比对。
所以当扩增条件不稳定时,引物并不在特定区域延伸复制,而选取DNA中其他区域另一匹配位置复制延伸,造成非特异性峰。
4、引物设计
1)设计引物长度一般为18-30bp,如果太短,更容易在DNA模板其他区域匹配复制,易形成非特异性峰。
如果太长,虽然可避免非特异峰,但不容易复制,要升高退火温度。
2)设计引物一般选取特定模板区两边的保守区。
3)标记引物,在引物5”端添加荧光素
5、D13与THO1竞争严重该如何处理?
(D13高,TH01低)
退火温度上调1-2℃(一般情况下只上调1℃)
6、DNA的三种形态:
①线状:
松弛线性的L构型(中)
②环状:
松弛开环的OC构型(慢)
③螺旋状:
超螺旋的SC构型(快)
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