实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项Word文件下载.docx
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1.准备足够量的1.5ml的EP管、两个100ml的离心管、0.22μm水系滤器、注射器、蒸馏水,以上用品均要进行高压灭菌。
2.洁净工作台紫外灭菌,然后进行以下操作。
3.称取2g的氨苄青霉素粉末于离心管中,加入灭菌水至总体积为20ml,轻摇离心管,至氨苄青霉素粉末完全溶解,以免过滤时堵塞滤膜。
4.用注射器吸取配制好的溶液,然后把滤器安在注射器上,缓缓推动注射器活塞,把溶液经滤膜推至100ml的离心管中。
动作要缓和,使滤出液出口正对着离心管,还要防止染菌。
5.把100ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5ml的EP管中,每管0.5ml。
在EP管上做好标记,包括名称、浓度、日期等。
6.把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
当你发现你使用的是最后一管抗生素时,请马上告知有关人员及时配制,以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度
名称
储存浓度
工作浓度
氨苄青霉素(ampicillin)
100mg/ml
50μg/ml~100μg/ml
卡那霉素(kanamycin)
10mg/ml
10μg/ml~50μg/ml
氯霉素(chloramphenicol)
25mg/ml
12.5μg/ml~25μg/ml
链霉素(streptomycin)
50mg/ml
四环素(tetracyyline)
IPTG
1M
0.05-0.6mM
三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制
分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。
四、总DNA的提取
具体步骤参考试剂盒说明书。
革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。
五、基因扩增
1.引物与合成:
设计引物序列,发至生工公司进行合成()。
2.引物配制:
合成后的引物先离心至管底,然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM,分装至无菌EP管中,做好标记(一定要标记浓度!
)后,于-20度保存备用。
3.PCR反应体系配制:
将所需各组分在冰浴中化开后,进行PCR反应体系配制。
反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行,以transgen的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例,100μl反应体系为:
10×
buffer10µ
l,dNTP(10mM)2µ
l,引物各2µ
l(10-50μM),模板1µ
l(根据浓度加减体积),Taq酶1µ
l,ddH2O82µ
l(注意:
加入顺序为:
水,buffer,dNTP,引物,模板,酶)。
涡旋混匀,分装至四-五管,瞬时离心。
若反应时间较长在反应混合液的上层加10-20µ
l的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。
4.将管放入PCR仪中,在PCR仪上设置好PCR反应参数,例如:
94℃5min,94℃40sec,Tm55℃1min,72℃2min,72℃10min,16℃1h,一般设30个循环。
待温度降至16℃后停止PCR仪,尽快取出样品,不允许过夜。
六、琼脂糖核酸电泳
1.电泳缓冲液的配制:
电泳缓冲液一般为TAE(或TBE),其配制方法参见表2,先配制50×
母液放于4度冰箱中,电泳时稀释100倍使用。
2.将制胶模具和梳子冲洗干净,架好梳子;
3.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶(表3):
准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液;
4.放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(一般沸三次即好),冷却片刻,倒入制胶模具中,待其凝固;
a)室温下30-45分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内;
b)向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去;
c)在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液(1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚蓝),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内;
5.接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。
根据胶的长度设定电压,一般5-8V/cm,电泳20-40min,溴酚蓝跑完胶板的3/4左右即可;
6.电泳完毕,关上电源,戴上手套,将胶放入0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中,室温下染色5-10min。
7.蒸馏水中漂洗一下,置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
如果要切胶回收,最好在观察台上铺上塑料片观察,防止污染以及紫外灯引起DNA突变。
溴化乙锭(EB)有剧毒,操作时应注意安全,戴手套操作。
可是要避免污染染色池和切胶板以外的区域。
操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。
表2.电泳缓冲液TAE配方
电泳缓冲液配方
缓冲液
使用液
浓贮存液(每升)
Tris-乙酸(TAE)
0.5×
:
0.02mol/LTris-乙酸
50×
242gTris碱
0.0005mol/LEDTA
57.1ml冰乙酸
100ml0.5mol/LEDTA
(pH8.0)
表3.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA的最佳分辨范围(bp)
0.5%
1,000~30,000
0.7%
800~12,000
1.0%
500~10,000
1.2%
400~7,000
1.5%
200~3,000
2.0%
50~2,000
七、回收与连接
1.将切下的目的条带按照回收试剂盒说明书进行产物回收;
2.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
稀释好的T载体浓度为12.5ng/μl,不用再确定浓度,每次用量为1μl。
3.连接反应体系的配制
(1)用SolutionI连接时,取一只分装的SolutionI离心管(含5μlSolutionI),加入待连接的两个DNA样品:
载体与片段(载体与片段的mol比为1:
3-5),加水补足10μl。
(2)用T4连接酶5μl连接时,取一只灭菌PCR管,加入10×
连接buffer1μl,待连接的两个DNA样品:
3-5),T4连接酶1μl,加水补足10μl。
(3)连接至T载体时反应体系一般为:
回收的PCR产物4μl,solutionI5μl,4倍稀释的pMD-18T克隆载体(12.5ng/μl)1μl。
水,buffer,DNA样品,酶
4.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
5.将离心管置于16℃孵育4h以上或过夜。
八、E.coliDH5α和Bl21感受态细胞的制备
采用CaCl2制备法制备E.coliDH5α感受态细胞,步骤如下:
1.准备实验:
(1)准备LB固体培养基和分装于试管(2-5ml)和三角瓶(100ml)的液体培养基。
(2)分别配制含15%甘油的和不含甘油的0.1MCaCl2。
(3)准备干净培养皿、非常干净的100ml离心管2只,1.5mlEP管50只,1ml和200μl枪尖各一盒。
(4)将以上培养基和物品高压灭菌。
2.在LB平板上活化E.coliDH5α。
将活化的E.coliDH5α单菌落接种于成含LB培养基的试管中,37℃摇床过夜培养。
3.第二天按1%接种量接种到含100mlLB培养基的三角瓶中,37℃摇床培养至OD600=0.4-0.6(约2h)。
4.冰浴10min,倒入灭过菌的100ml离心管中离心,4000rpm,10min,4℃。
5.去掉上清,加20ml配制好的已灭菌的0.1MCaCl2,将菌体打散后静置20min,4000rpm离心10min,去掉上清。
6.加1-2ml灭菌的0.1MCaCl2(含15%甘油)制成感受态细胞。
将制好的感受态细胞分装成50μl小份保存于-80℃冰箱。
7.E.coliBl21和BL21(DE3)的制备方法同上。
(1)所有操作均在冰上进行;
(2)整个制备过程必须保证无菌操作;
(3)E.coliBl21,BL21(DE3),DH5α菌种每学期更换一次。
九、转化
1.取50μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入10μl连接产物或3-5μl纯质粒,轻轻吹打混匀,冰浴20min。
3.放入42℃水浴中热激90秒,立即放入冰浴中2-10min。
4.加入0.5ml不含抗生素的LB液体培养基,于37℃培养1h。
5.将培养物4000rpm离心3min,保留约200μl上清于管中,将菌体用无菌枪尖轻轻打散,均匀涂布于含100μg/mlAmp+的平板表面,平板于37℃先正置1-2h,后倒置培养12-16h至菌落出现。
十、重组子的筛选和鉴定
从转化平板上挑取白色菌落,转接至含抗生素Amp+(100μg/ml)的LB液体培养基,37℃振荡培养过夜。
菌液能够用以下三种方法验证是否是阳性转化子。
同时培养阴性菌落作为对照!
(一)酚抽验证
取1ml菌液12,000rpm离心1min收集菌体,尽量倒干净上清后加入50μlTris饱和酚和50μl水,漩涡震荡5min充分混匀。
12,000rpm离心10min后迅速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
(二)质粒酶切验证
1.按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取,用未插入片段的质粒作为阴性对照,进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳后可根据质粒的大小初步判断质粒中是否有插入片段,并推测质粒的浓度。
2.利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点,对质粒进行酶切。
根据待切质粒的浓度确定要加的体积,选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
3.在离心管中加入如下成分:
Buffer2μl
待切样品xμl(一般为5μl左右)
酶1μl10U/ul
加灭菌水补足20μl
酶的多少并不是一成不变的,关键要看待切DNA的浓度,如果浓度较低,能够适当少加酶。
不要在20μl体系中加入超过2μl的酶,那样容易产生星号活性。
4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
5、将离心管置于37℃中温育2h,若待切样品为PCR产物,则可将反应时间适当延长。
最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。
如果50μl体系加入1μl酶,则可过夜酶切一般不会出现星号活性。
6、用未酶切的质粒作为对照,琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
当酶切样品用于回收而不是鉴定时,可按比例适当扩大反应体积。
不同内切酶最适酶活温度不同,如BamHI最适酶活温度为30℃。
双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer,但要注意不能有星反应。
(三)菌落PCR
挑取培养皿上的部分菌落或取0.5-1.0μl菌液作为模板进行PCR扩增,每管反应体系最低可少至10μl,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
若为阳性转化子,可检测到插入的目的条带。
将鉴定好的阳性转化子菌液500μl送上海博尚生物技术有限公司进行序列测定。
冬天温度很低时需做成甘油管样品送测!
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- 实验室 分子生物学 实验 基本 操作 规范 注意事项