发酵工程期末复习题Word格式.docx

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▪生物转化

第二章发酵工程菌种

一发酵工业中常用微生物菌种（了解）

（一）细菌

1、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）2、大肠杆菌（Escherichiacoli）3、乳酸杆菌（Lactobacillussp.）4、丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutyleum）5、肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）6、醋酸菌（Acetobacter）7、棒状杆菌（Corynebacterium）8、短杆菌（Brevibacterium）9、黄单胞菌（Xanthomonas）

10、假单胞菌（Pseudomonas）

（二）放线菌

1、链霉菌属（Streptomyces）2、小单胞菌属（Micromonospora）3、游动放线菌属（Actinoplanes）4、诺卡氏菌属（Norcadia）5、孢囊链霉菌属（Streptosporangium）

（三）酵母菌

1、啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、葡萄汁酵母（Saccharomycesuvarum）4、球拟酵母（Toruiopsis）5、假丝酵母（Candida）6、红酵母（Rhodotorula）7、棉病针孢酵母（Nematsporagossypii）8.毕赤氏酵母（Pichia）

（四）霉菌

1、根霉（Rhizopus）2、毛霉（Mucor）3、曲霉（Aspergillus）4、青霉（Penicillum）5、白地霉（Geotrichumcandidum）6、产黄头孢霉（Cephalosporiumchrysogen）

二.尽管工业用微生物菌种多种多样，但作为大规模生产，选择菌种应遵循以下原则：

1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高；

2、培养条件易于控制；

3、生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；

4、满足代谢控制的要求；

5、选育抗噬菌体和杂菌能力强的菌株；

6、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。

7、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。

8、发酵过程中产生的泡沫少，有利于提高装料系数和单罐产量，降低生产成本；

9、对需要添加的前体物质有耐受能力，且不能将前体物质作为碳源使用。

三.发酵工程工业生产水平

的三个决定要素:

生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备

四.高产培养基设计的几个原则

●制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素；

¡

使用一聚合或复合形式的生长限制养分；

避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏；

确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；

使用pH缓冲剂以减少pH变化；

前体、促进剂及抑制剂的采用。

五.菌种选育：

自然选育

诱变育种

杂交育种（有性、准性）

原生质体融合育种

基因工程育种　

六.自然选育：

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。

自发突变（spontaneousmutation），也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。

自然选育的一般程序：

制备单孢子（单细胞）悬液

∨

适当稀释

在固体平板上分离

挑取部分单菌落进行生产能力测定

经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株

七.诱变育种

表型迟延现象：

遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。

第三章种子扩大培养

一.种子扩大培养：

定义：

菌种的扩大培养就是把保藏在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。

这些纯种的培养物称为种子。

二.作为生产用种子的准则

1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。

2）生理性状稳定

3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求

4）无杂菌污染

5）保持稳定的生产能力

三.种子罐种子制备的工艺工程因菌种不同而异，一般可分为：

一级种子、二级种子、三级种子

◆对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少。

如：

谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10h，菌体浓度达108～109个/ml，即可接入发酵罐作为种子。

这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。

◆生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10～24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子。

这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。

一般50m3发酵罐都采用三级发酵

生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）

在小型罐（5～500L）中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵。

四.移种方式：

1）单种：

一个种子罐接种到一个发酵罐中。

2）双种：

为加大接种量，两个种子罐接种到一个发酵罐中。

3）倒种：

种子罐染菌又无备用种子时或种子质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒出部分给另一发酵罐。

4）混种：

一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。

五.种龄——种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

六.接种量——是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

（接种量：

细菌1-5%，酵母5-10%，霉菌10-20%）

大多数抗生素发酵的最适接种量为7～15%，有时可增加到20～25%；

而由棒状杆菌生产谷氨酸接种量只需1%。

除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的各阶段接种量一般均需0.5～10%的接种量。

七.种子质量的判断

1、细胞或菌体

2、生化指标通常测定的参数有：

1）pH

2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化

3）菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等）

4）其它参数，如某种酶的活力

3、产物生成量

4、酶活力

第四章发酵工业原料及其处理

一.培养基基本要求：

1）都必须含有作为合成细胞组成的原料。

2）满足一般生化反应的基本条件，如碳源、氮源、无机盐、生长因子；

3）一定的pH等条件。

4）工业生产培养基所用的原材料必须来源丰富、价格低廉、质量稳定。

二.培养基的成分及来源

1.、碳源

2.、氮源

3.、无机盐及微量元素

4.、生长因子

5.、前体、促进剂和抑制剂

☐碳源

常用碳源：

糖类、油脂、有机酸和低碳醇。

各种菌种对不同碳源的利用速率和效率不一样。

☐氮源

1.有机氮源

2.无机氮源

❑有机氮源和无机氮源应当混合使用

早期：

容易利用易同化的氮源—无机氮源

中期：

菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质

3.有机氮源常用：

花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白陈、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。

它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被吸收后再进一步分解代谢。

成分复杂：

除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。

4.无机氮源：

⏹常用的有：

铵盐、硝酸盐和氨水等。

⏹无机氮源的迅速利用会引起pH的变化。

⏹生理酸性物质：

硫酸铵。

⏹生理碱性物质：

如硝酸钠。

在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；

硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质。

⏹正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。

5.无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮源；

蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，属迟效氮源。

三.前体：

◆指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中能直接结合到产物中，而自身结构没有多大变化，但是产物产量却有较大提高。

抑制剂：

会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。

促进剂：

指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。

四.培养基成分和配比的选择

☐注意事项：

1、要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配比。

2、选用适当的碳氮比。

3、要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。

培养基设计与优化的任务：

☐确定最佳成分组成

☐确定各成分的最佳配比

☐确定最佳pH

☐确定最佳配制工艺

培养基中影响菌体生长和产物形成的因素：

☐培养基组成（包括原料来源与加工方法）

☐配比

☐缓冲能力

☐黏度

☐消毒是否彻底

☐消毒对营养的破坏程度

☐原料的杂质

五.

水解方法三类：

酸水解（副反应多，最差），酶水解（生产周期长），酸酶结合水解法

☐酸解法

工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。

副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。

对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。

☐酶解法

（1）反应条件温和，不需高温、高压设备。

（2）副反应少，水解糖液纯度高。

（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓

度下水解。

（4）糖液颜色浅，质量高。

（1）生产周期长，一般需要48小时。

（2）需要更多的设备，且操作严格。

☐酸酶结合法集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。

根据原料淀粉性质分：

酸酶法酶酸法

六.发酵培养基灭菌

培养基的灭菌方法：

化学试剂灭菌法，射线灭菌法，干热灭菌法，湿热灭菌法，过滤除菌法，火焰灭菌法

致死温度：

杀死微生物的极限温度。

致死时间：

在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。

热阻：

对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。

相对热阻：

几种微生物对热的相对抵抗能力。

指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。

对数残留定律：

在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。

在灭菌过程中，微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比,对数残留定律。

-dN/d=N

N：

培养基中活的微生物个数；

：

时间（s）;

比死亡速率（s-1）（死亡速率常数）

dN/d：

微生物的瞬间变化率，即死亡速率

微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率

常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：

K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数.

A—比例常数

E—杀死细菌所需的活化能，（E）（×

4.18J/mol）

T—绝对温度，（K）

R—气体常数，[1.978×

4.18J/（mol·

K）]

e—2.71（exp）

影响灭菌的因素：

微生物细胞中水分对灭菌的影响

细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低

◆微生物细胞菌龄对灭菌的影响

老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高

◆培养基的物理状态对灭菌的影响

◆培养基中微生物数量对灭菌的影响

1.为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，灭菌温度就得相应高些？

答：

培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞周围形成一层薄膜，影响热的传递；

因此，在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。

高浓度盐类、色素能削减其耐热性。

2.灭菌的彻底与否应以杀死营养细胞为准还是杀死细菌孢为标准，为什么？

3.在灭菌过程中，为什么说培养基发生泡沫对灭菌很不利？

泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。

因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度，延长灭菌时间。

4.问题判断

培养基的PH值越低，灭菌所需的时间就愈短。

（）

在实际生产中，不宜采用严重霉腐的腐败的水质，是因为其微生物数量多，影响灭菌效果。

在灭菌过程中，充分搅拌更有利于灭菌。

年轻细胞比年老细胞更易杀死。

微生物含水量越多，灭菌时间就得越长。

七.

空消：

实消：

连消：

第五章无菌空气的制备

一.无菌要求：

在发酵过程中不因空气染菌而造成损失。

一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经除菌后空气的无菌程度为N=10-3。

二..空气的除菌方法

1.辐射杀菌2．热杀菌3．静电除菌4．过滤除菌法

三…空气过滤除菌

空气过滤除菌的原理

●深层过滤：

以棉花、玻璃纤维、活性炭为过滤介质。

介质过滤是以大空隙的介质过滤层除去较小颗粒，这显然不是面积过滤（即不是绝对过滤），而是一种滞留现象。

这种滞留现象是由多种作用机制构成的，主要有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重力沉降和静电吸引等。

四.过滤除菌流程的设备（了解）

常用的过滤介质：

1）棉花2）活性炭3）玻璃纤维4）玻璃纤维纸

☐第六章氧的供需与传递

1.呼吸强度（比耗氧速率）

单位质量的菌体（以干重计）在单位时间内消耗氧的量mmolO2/（g干细胞·

h）。

用Qo2表示。

2.耗氧速率

指单位体积培养液在单位时间内的消耗氧的量，以r表示，单位为[mmolO2/L·

h]。

3.临界氧浓度：

在溶氧浓度低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增加而变化时的溶解氧浓度。

用C临界表示

☐临界溶氧浓度CCr:

指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。

4.饱和溶氧浓度：

在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。

（mmol/L）

5.最适氧浓度：

6.氧的传递

☐供氧：

空气中的氧从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。

☐耗氧：

氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜扩散到细胞内

①从气泡中的气相扩散通过气膜到气液界面；

②通过气液界面；

③从气液界面扩散通过气泡的液膜到液相主体；

④液相溶解氧的传递；

⑤从液相主体扩散通过包围细胞的液膜到大细胞表面；

⑥氧通过细胞壁；

⑦微生物细胞内氧的传递；

通常③和⑤步传递阻力最大，是整个过程的控制步骤

7.测定溶氧传递系数的方法：

亚硫酸盐氧化法，取样极谱法，排气法，物物料衡算法，动态法。

第七章微生物发酵机制

1.酵母菌酒精发酵一型：

酵母菌酒精发酵三型：

酵母菌酒精发酵Ⅱ型

1mol葡萄糖只产生1mol甘油，不产生ATP，整个过程无ATP积余，可见在甘油发酵过程中亚硫酸盐不能加得太多，否则会使酵母菌因得不到能量而终止发酵，必须留一部分酒精发酵，以使获得一些能量，供生命活动所需。

该过程也称酵母菌的II型发酵。

2.同型乳酸发酵：

进行乳酸发酵的主要是细菌。

它们利用糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。

发酵产物中主要为乳酸的称为同型乳酸发酵。

如乳链球菌（Streptococcuslactics）、乳酪球菌（Streptococcuscremoris）、干酪乳杆菌（lactobacilluscasei）、

保加利亚乳杆菌（Lac.bulgaricus）等。

异型乳酸发酵：

发酵产物中除乳酸外同时还有比例较高的乙酸、乙醇、二氧化碳等，称为异型乳酸发酵。

其生物合成途径有两种。

1.6-磷酸葡萄糖酸途径2.Bifidus途径（双歧途径）

3.柠檬酸的发酵机制

柠檬酸的合成途径

黑曲霉（Asp.niger）　　　

原料：

糖类，乙醇，醋酸

途径：

EMP（HMP）

丙酮酸羧化

TCA环

黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：

1，生产柠檬酸时为4：

1。

葡萄糖-----------＞柠檬酸（citricacid）

理论转化率：

106.7%

柠檬酸积累机理：

1、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了EMP途径的畅通。

2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。

3、在控制Fe++含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。

顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡

柠檬酸：

顺乌头酸：

异柠檬酸＝90：

3：

7

柠檬酸积累的代谢调节：

☐糖酵解及丙酮酸代谢的调节

☐三羧酸循环的调节

☐及时补加草酰乙酸

柠檬酸的发酵机制：

4.谷氨酸合成途径

谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌属于生物素缺陷型菌种

5.许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。

糖代谢的中间体，既可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰CoＡ。

微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。

第八章发酵动力学

得率：

是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。

生长得率：

是指每消耗1g（或mo1）基质（一般指碳源）所产生的菌体重（g）。

转化率：

指投入的原料与合成产物数量之比。

基质比消耗速率（qs，g（或mo1）／g菌体·

h）：

指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量。

它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。

在比较不同微生物的发酵效率上这个参数很有用。

产物比生产速率（qp，g（或mo1）／g菌体·

指每克菌体在一小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速度或能力，可以作为判断微生物合成代谢产物的效率。

分批培养（batchculture）指在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物进行发酵的方法。

连续培养（continuousculture）指在一开放系统中，以一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基，同时以相同速度将含有微生物和产物的培养液从发酵罐内放出，从而使发酵罐内液体量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长和进行代谢活动的方法。

补料分批培养（fed-batchculture）指在分批发酵中间歇地或连续地补加（流加）新鲜培养基的方法。

2.分批培养中的产物形成：

Ⅰ型：

生长偶联产物生成——菌体生长、碳源利用和产物形成几乎在相同时间出现高峰。

产物形成直接与碳源利用有关。

Ⅱ型：

生长与产物生成部分偶联——在生长开始后并无产物生成，在生长继续进行到某一阶段才有产物生成。

产物形成间接与碳源利用有关。

Ⅲ型：

非生长偶联产物生成——在生长停止后才有产物生成。

产物形成与碳源利用无准量关系。

分批发酵中生长和产物形成的关系：

第九章发酵过程的控制

1.代谢参数按性质可分为三类：

Ø

物理参数：

温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等

化学参数：

基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等

生物参数：

菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、摄氧率、关键酶活力等

直接参数：

如T、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等

间接参数：

将直接参数通过公式计算获得的

如摄氧率（γ）、呼吸强度（QO2）、比生长速率（μ）、体积溶氧系数（KLa）、呼吸商（RQ）等。

2.发酵热：

------发酵过程中释放出的净热量。

[J/m3·

h]

或------单位体积的发酵液在单位时间内释放出来的净热量。

Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显–Q辐射

生物热：

产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热，此为生物热。

搅拌热（Q搅拌）：

搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体和设备之间的摩擦，产生数量可观的热。

蒸发热（Q蒸发）：

空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所需的热量即为蒸发热。

显热（Q显）：

排出气体所带的热

辐射热（Q辐射）：

因罐内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。

辐射热的大小决定于罐内外的温差

3.温度对发酵的影响体现在影响发酵动力学特性，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物大的代谢调节机制，影响发酵液的理化性质和产物的生物合成。

四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。

在低于30℃下，该菌合成金霉素能力较强；

温度提高，合成四环素的比例提高；

在温度达到35℃时，则只产生四环素，金霉素的合成停止。

温度对发酵的影响：

1）温度影响产物合成的速率及产量

2）温度可能会影响终产物的质量

3）温度还可能影响生物合成的方向

4.最适温度：

是指在该温度下最适于菌的生长或产物的形成。

在发酵的整个周期内仅选一个温度不一定好。

因为最适合菌生长的温度不一定适合产物的合成。

发酵过程中，在生长初期抗生素还未开始合成，菌丝还未长浓，这时的温度应适于微生物的生长；

到抗生素分泌期，菌丝已长到一定浓度，积累抗生素是重点考虑，此时应满足生物合成的最适温度。

5.引起pH下降的因素：

（凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发酵，其pH都会下降）

1）培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降。

2）消泡油加得过多

3）生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降

引起pH上升的因素：

（凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗的发酵，其pH都会下降）