第十一单元 第45讲Word文件下载.docx

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为了选择该期的花药，通常选择____________的花蕾。

确定花粉发育时期最常用的方法有____________法，但是对于花粉细胞核不易着色的植物，需采用____________法，该法能将花粉细胞核染成____________色。

（2）若要进行兰花无病毒植株的培育，首先选择兰花的____________作为外植体。

从外植体到无病毒植株试管苗，要人为控制细胞的____________和____________过程。

（3）进行组织培养需配制MS培养基，在该培养基中常需要添加____________、____________等植物激素。

欲有利于根的分化，植物激素的用量比例应为________________________________________________________________________。

（4）不同植物的组织培养除需营养和激素外，____________________________等外界条件也很重要。

（5）无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中使用化学药剂进行消毒的是____________，采用灼烧方法进行灭菌的是____________。

（填序号）

①培养皿　②培养基　③实验操作的双手　④三角锥形瓶⑤接种环　⑥花蕾

答案　

（1）单核靠边　完全未开放　醋酸洋红　焙花青—铬矾　蓝黑　

（2）茎尖分生组织　脱分化（或去分化）　再分化（3）生长素　细胞分裂素（两空顺序可以颠倒）　生长素多于细胞分裂素　（4）pH、温度和光照　（5）③⑥　⑤

解析　

（1）早期的花药比后期的更容易培养成功。

一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。

该时期的花药通常存在于完全未开放的花蕾中。

（2）根尖、茎尖约0～0.1mm区域中几乎不含病毒。

病毒通过维管系统移动，而分生组织中不存在维管系统，且茎尖分生组织中，代谢活力高，竞争中病毒复制处于劣势。

（3）生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。

当生长素含量多于细胞分裂素含量时，利于生根。

（4）植物培养时，除需要营养、激素外，还需要适宜的温度、pH和光照等。

（5）对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。

1．植物组织培养技术和花药离体培养技术的异同

　　项目

内容　　

菊花的组织培养

月季的花药培养

理论依据

植物细胞的全能性

基本过程

脱分化→再分化

外植体的细胞类型

体细胞

生殖细胞

操作流程

制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培

选材→消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培选育

影响因素

选材、营养、植物激素、pH、温度、阳光等

培养结果

正常植株

单倍体植株

生殖方式

无性生殖

有性生殖

可育性

可育

高度不育，秋水仙素处理后可育

2．植物激素与组织培养

（1）生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点：

①在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。

②使用顺序不同，结果不同，具体如下：

使用顺序

实验结果

先使用生长素，后使用细胞分裂素

有利于细胞分裂，但细胞不分化

先使用细胞分裂素，后使用生长素

细胞既分裂也分化

同时使用

分化频率提高

③用量比例不同，结果也不同

（1）材料：

植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。

一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。

嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

（2）营养：

常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

（3）环境条件：

pH、温度、光照等条件。

如菊花的组织培养所需pH为5.8左右，温度为18～22℃，光照条件为每日用日光灯照射12h。

考点二　DNA的粗提取与鉴定

1．基本原理

2．操作过程

材料的选取：

选用DNA含量相对较高的生物组织

去除杂质：

利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的

　　不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质

DNA的鉴定：

在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水

　　　　中加热5min，溶液变成蓝色

易错警示　

（1）本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。

可选用鸡血细胞作材料。

（2）实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。

2．下图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：

（1）步骤一中，向鸡血细胞液中加入____________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。

（2）步骤二中，过滤后收集含有DNA的____________。

（3）步骤三、四的操作原理是________________________________________________

________________________________________________________________________；

步骤四中，通过向溶液中加入____________调节NaCl溶液的物质的量浓度至____________mol/L时，DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。

（4）步骤七：

向步骤六过滤后的____________中加入等体积的冷却的____________，静置2～3min，溶液中会出现________色丝状物，这就是粗提取的DNA。

（5）步骤七：

DNA遇____________试剂，沸水浴5min，冷却后，溶液呈______色。

答案　

（1）蒸馏水　

（2）滤液　（3）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质　蒸馏水　0.14　（4）滤液　酒精　白　（5）二苯胺　蓝

解析　破碎红细胞应用蒸馏水，使之吸水涨破。

DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA析出。

可通过加入蒸馏水将2mol/L的NaCl溶液稀释为0.14mol/L的NaCl溶液。

DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加热呈蓝色。

1．DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较

2mol/LNaCl溶液

0.14mol/LNaCl溶液

溶解规律

DNA

溶解

析出

蛋白质

部分发生盐析沉淀

NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大

2．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较

试剂

浓度

用途

原理（“△”为实验的主要原理）

NaCl溶液

2mol/L

溶解DNA

DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2mol/L时最大、在0.14mol/L时最小

△

0.14mol/L

析出DNA

鉴定时的溶剂

酒精

95%（体积分数）

除去杂质以提纯DNA

DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可以溶于酒精

二苯胺

鉴定剂

DNA遇二苯胺（沸水浴）会变蓝色

柠檬酸钠

0.03g/mL

抗凝剂

除去血液中的钙离子，防止血液凝固

3．DNA粗提取实验材料和方法的选择

（1）不同生物的组织中DNA含量不同

在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

（2）材料不同所采用的提取方法不同

①植物组织：

取材→研磨→过滤→沉淀。

②鸡血：

制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。

考点三　PCR技术的基本操作和应用

1．PCR原理

DNA热变性原理，即：

2．PCR反应过程

（1）变性：

当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链。

（2）复性：

温度下降到55_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

（3）延伸：

温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、C、G）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

易错警示　

（1）DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：

在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：

在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：

缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。

反应场所：

PCR仪。

（2）PCR技术中的引物：

①含义：

引物是一小段单链DNA或RNA分子。

②作用：

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。

③种类：

扩增一个DNA分子需要2种引物。

④数目：

引物数目等于新合成的DNA子链数目。

⑤与DNA母链的关系：

两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。

3．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：

（1）DNA的两条链是反向平行的，通常将________________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的____________开始延伸DNA链。

（2）PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。

到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到__________________________________，它的发现和应用解决了上述问题。

要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。

（3）PCR的每次循环可以分为______________________三步。

假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。

（4）请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。

（5）简述PCR技术的主要应用。

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

答案　

（1）磷酸基团　3′端　

（2）耐高温的TaqDNA聚合酶　选择培养基　（3）变性、复性和延伸　32

（4）如图所示

（5）遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定（要求3项以上）

解析　

（1）DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。

（2）因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。

用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。

（3）DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。

（4）新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。

（5）PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。

1．细胞内DNA复制与PCR技术的比较

细胞内DNA复制

PCR

不同点

解旋

在DNA解旋酶作用下，边解旋边复制

80～100℃高温解旋，双链完全分开

酶

DNA解旋酶、DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶

引物

RNA

DNA或RNA

温度

体内温和条件

高温

相同点

①需提供DNA复制的模板

②四种脱氧核苷酸为原料

③子链延伸的方向都是从5′端到3′端

2．PCR的反应过程

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：

温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

考点四　血红蛋白的提取和分离

1．血红蛋白的提取和分离原理及方法

（1）原理：

蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

（2）分离方法

①凝胶色谱法：

也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

②电泳法：

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

常用的电泳法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2．血红蛋白的提取和分离过程

样品处理：

红细胞的洗涤―→血红蛋白的释放―→分离血红蛋白溶液

纯化：

用凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质

3．判断正误

（1）利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来（　×

（2）在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关（　×

（3）在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移率完全取决于分子的大小（　√　）

易错警示　“血红蛋白的提取和分离实验”中的注意事项

（1）红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；

要低速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

（2）凝胶的预处理：

用沸水浴法不但节约时间，而且除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。

（3）色谱柱的装填：

装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；

无气泡；

洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功的标志：

红色区带均匀一致地移动。

4．红细胞中含有大量的血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。

下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是（　　）

A．血红蛋白提取和分离一般按照样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定的顺序进行

B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液

C．粗分离中透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质

D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定

答案　B

解析　蛋白质的提取和分离一般分为四步：

样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

提取和分离血红蛋白时，首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；

再通过透析法除去相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；

然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品纯化，纯化过程中凝胶应用蒸馏水充分溶胀后，配制成凝胶悬浮液，而不是用生理盐水；

最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

1．常用的蛋白质分离方法

（1）凝胶色谱法

　　　蛋白质

项目

相对分子质量大

相对分子质量小

凝胶内部

不能进入

能进入

运动方式

垂直向下

垂直向下和无

规则扩散运动

经过路程

较短

较长

洗脱次序

先流出

后流出

（2）电泳法原理

①在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。

在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

②由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

2．分离DNA、PCR技术、分离蛋白质的比较

分离DNA

PCR技术

分离蛋白质

实验原理

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精

利用DNA热变性原理体外扩增DNA

依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质

实验过程

选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定

变性→复性→延伸

样品处理→凝胶色谱操作

获得较纯净的DNA

获得大量DNA

相对分子质量不同的蛋白质得以分离

实验意义

为DNA研究打下基础

解决了DNA研究中材料不足的问题

为蛋白质的研究和利用提供了原材料

3．比较琼脂糖凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（2）从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（3）从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

考点五　植物有效成分的提取

1．植物芳香油的提取

（1）提取玫瑰精油实验

①方法：

水蒸气蒸馏法。

②实验流程

（2）提取橘皮精油的实验

一般用压榨法。

2．胡萝卜素的提取

（1）胡萝卜素性质：

不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。

（2）实验设计

萃取法，石油醚最适宜作萃取剂。

（3）鉴定方法：

纸层析法。

易错警示　胡萝卜素粗品鉴定过程中的5个易错点

（1）层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显：

为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。

（2）点样时点样圆点太大（直径大于2mm），导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素：

点样圆点的直径应为2mm。

（3）将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触：

以避免由于毛细管现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。

（4）层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败：

层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。

（5）没设置标准样品作对照：

层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的β－胡萝卜素作对比予以确认。

5．请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：

（1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、________和________。

（2）芳香油溶解性的特点是难溶于________________，易溶于______________，因此可用________________作为提取剂来提取芳香油。

（3）橘子果实含有芳香油，通常可用________作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是____________________________________________________

________________________。

（4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是________。

（5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的________层，原因是____________________________________________________________________

加入氯化钠的作用是_________________________________________________________

______________________________。

（6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，其作用是___________________

_____________________________________________________。

答案　

（1）蒸馏法　萃取法　

（2）水　有机溶剂　有机溶剂（3）橘子皮　芳香油含量较高　（4）过滤　（5）上　油层的密度比水层小　增加水层密度，使油和水分层　（6）吸收芳香油中残留的水分

解析　植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法和萃取法。

一般采用新鲜的橘子皮来提取芳香油，因为新鲜的橘子皮芳香油含量较高。

除去液体中的固体常用的方法是过滤。

芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。

加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。

无水硫酸钠可以吸收芳香油中残留的水分。

植物芳香油提取方法的比较

提取方法

水蒸气蒸馏法

压榨法

有机溶剂萃取法

利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来

通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油

使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香油

方法步骤

①水蒸气蒸馏

②分离油层

③除水过滤

①石灰水浸泡、漂洗；

②压榨、过滤、静置；

③再次过滤

①粉碎、干燥

②萃取、过滤

③浓缩

适用范围

适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油

适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取

适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶液中

优点

简单易行，便于分离

生产成本低，易保持原料原有的结构和功能

出油率高，易分离

局限性

水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题

分离较为困难，出油率相对较低

使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量

1．（2012·

江苏卷，18）下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是（　　）

A．洗涤剂能瓦解细