Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究.docx
- 文档编号:1675572
- 上传时间:2022-10-23
- 格式:DOCX
- 页数:5
- 大小:20.66KB
Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究.docx
《Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究
Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究
马荣,陈曦海,唐丽萍,耿晓星,张云艳,张英蕾,王晶
【关键词】Survivin反义核酸;卵巢肿瘤;凋亡;多西他赛;多药耐药基因
ExperimentalstudyonapoptosisofovariancancercellsandreversaldocetaxeldrugresistanceinducedbySurvivinantisenseRNA
【Abstract】AIM:
ToestablishSurvivinantisenseRNAandexploreitseffectontheapoptosisofovariancancercellsandthesensitivitytodocetaxelanditsmechanismofreversingdocetaxeldrugresistance.METHODS:
Survivinantisenseeukaryoticvector(antipcDNA3svv)wastransferredintoSkov3cellsbyelectroporationandpositiveclonewasscreenedout.SurvivinproteinwasdetectedbyWesternblot;effectofapoptosisinducementwasobservedbyflowcytometry;sensitivitytodocetaxelwasexaminedbyMTT;expressionofMDR1mRNAwasdetected.RESULTS:
Survivinproteinofpositivelyclonedcellswerereducedobviouslyascomparedwiththatofnontransferedcells.Terminalapoptoticchangewasobservedbyflowcytometryandtheapoptosisratewas19%;IC50ofexperimentalgrouptodocetaxelwas(±)ng/mLandcontrolgroupwas±ng/mL,sothestatisticaldifferencewassignificant(P<.ExpressionofMDR1mRNAofSkov3SVVantigroupwasreducedobviouslyascomparedwiththatofSkov3group(P<.CONCLUSION:
SurvivinantisenseRNAcaninduceovariancancercellapoptosisandincreasethesensitivitytodocetaxelbyreducingtheexpressionofMDR1mRNA.
【Keywords】survivinantisenseRNA;ovarianneoplasms;apoptosis;docetaxel;MDR1
【摘要】目的:
构建Survivin反义真核表达载体(antipcDNA3svv),探讨其对卵巢癌的凋亡诱导作用、对多西他赛的化疗增敏作用及逆转耐药的机制.方式:
采纳Survivin反义核酸瞬时电转染法转染卵巢癌细胞系Skov3,挑选出阳性细胞株.以Westernblot检测Survivin蛋白的表达,用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用,采纳MTT法检测其对多西他赛的化疗增敏作用,并检测实验组细胞(Skov3SVVanti)MDR1mRNA的表达.结果:
稳固表达antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其Survivin蛋白表达比未转染者明显降低,Skov3SVVanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%,对多西他赛的IC50值为(±)ng/mL,而对照组(Skov3)为±ng/mL,不同具有明显的统计学意义(P<.Skov3SVVanti组MDR1mRNA表达较Skov3组明显减少(P<).结论:
Survivin反义核酸可诱导卵巢癌细胞凋亡,并通过降低MDR1mRNA表达增强多西他赛化疗灵敏性.
【关键词】Survivin反义核酸;卵巢肿瘤;凋亡;多西他赛;多药耐药基因
0引言
上皮性卵巢癌是常见的妇科肿瘤,具有易转移及复发的特性,因此手术后化疗是卵巢癌标准化医治最重要的内容之一.多西他赛(docetaxel)又名泰索帝是医治卵巢癌的新药,其联合铂类医治卵巢癌临床减缓率远高于铂类联合其他化疗药.可是关于一些复发和多处转移的患者,多西他赛也产生了耐药现象.Survivin是新近发觉的IAP(inhibitorofapoptosisprotein)家族成员,能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用.已有研究证明[1],Survivin基因的高表达与化疗耐药有紧密关系,抑制Survivin基因的表达能增加肿瘤组织对化疗的灵敏性,关于维持正常细胞生物学特性具有重要作用[2].本研究旨在研究应用反义策略阻断Survivin表达,对诱导卵巢癌细胞凋亡及提高卵巢癌细胞多西他赛灵敏性的作用,并进一步探讨其逆转耐药的机制.
1材料和方式
细胞株和细胞培育人卵巢癌细胞株Skov3由哈尔滨医科大学肿瘤研究所惠赠.用含有100mL/L胎牛血清(Gibco公司)的RPMI1640(Gibco公司)培育(37℃,50mL/LCO2).顺铂(&CoLtd公司)及多西他赛(AventisPharma,Dagenham公司)溶解于DMSO(Gibco公司),4℃保留.
反义真核表达载体(antipcDNA3svv)的构建Survivin基因通过RTPCR方式克隆取得.应用Trizol(Takara公司)法从卵巢癌细胞株Skov3中抽提总RNA,正向引物为5′atattctagaccatgggtgccccgacgttgc3′,反向引物5′aatcgaattctcaatccatggcagccagctg3′.PCR扩增条件为:
94℃预变性2min,94℃1min,60℃1min,72℃1min,共30循环,72℃延伸10min,扩增产物用琼脂糖回收试剂盒回收提纯后,扩增产物进行结尾连接腺嘌呤(A)反映,与带有胸腺嘧啶结尾(T)的载体(Invitrogen公司,CTGFPTOPO)连接.重组体转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选Amp阳性克隆者小量抽提质粒(质粒抽提试剂盒Takara公司),送去测序(上海生工公司).经测序,选出其中反向连接者,命名为antipcDNA3svv.
电转染Skov3细胞及阳性克隆的挑选搜集6×106细胞于预冷的cm电转杯中,加入antipcDNA3svv15μL,终体积800μL,300V电压电穿孔ms,48h后传代培育,加入含有G418的培育基挑选阳性克隆,浓度由200mg/L渐加至800mg/L,共挑选42d,可见有抗性细胞生长,命名为Skov3SVVanti.上述一样条件空质粒转染Skov3,挑选出阳性克隆命名为Skov3neo.分为3组:
Skov3SVVanti组(实验组)、Skov3neo组(空质粒组)及Skov3组(空白对照组).
转染细胞Survivin蛋白表达的检测将3组细胞培育48h,PBS漂洗3次后加入4℃的50μL裂解液,冰浴20min,12000g/min离心后取上清液.Bradford法测定蛋白浓度.取每种样品各40μg,100g/LSDSPAGE凝胶电泳分离,通过点转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜后在含有50g/L脱脂奶粉的TTBS中37℃封锁90min,加入1∶1000羊抗人Survivin(上海中山公司),4℃留宿,TTBS充分漂洗后加入1∶4000兔抗羊lgG/HRP(上海中山公司),室温孵育1h,TTBS充分漂洗,洗膜后加入LumiGLO化学发光试剂作用1min.X线暗室曝光,常规显影定影.一样实验条件重复4次.图像以BioRad图像分析系统分析,用蛋白条带的平均光强度值表示Survivin表达的相对强度.
流式细胞仪观看肿瘤细胞凋亡细胞传代培育48h后,搜集10×106个细胞,分成10个样本,每一个样本1×106个细胞.用700mL/L的乙醇0℃固定,留宿,PBS洗涤并重悬细胞,加入PI染液1mL(EB10μg,PI50μg,RNaseⅠ酶10μg,枸橼酸钠5mg,TritonX100为μL,加生理盐水至1mL),室温下孵育30min,流式细胞仪检测.观看亚二倍体峰的转变.凋亡率采纳上述样本的均值.结果以lysisⅡ软件分析.
细胞对多西他赛灵敏性分析(MTT)备96孔板,每孔加入100μL的1×105的Skov3,Skov3neo,Skov3SVVanti细胞,每种细胞加7孔,其中1孔做调零用,每孔依次加入0,1,10,20,50,100(μg/L)多西他赛,37℃培育48h后,每孔加入MTT(10g/L)10μL,培育4h,弃上清液,每孔加入150μL二甲基亚枫(DMSO),振荡10min,酶标仪测定490nm处吸光度(A)值.依照A值计算细胞存活率并计算细胞生长抑制50%的多西他赛浓度,即IC50值.记录加多西他赛50μg/L后0,24,48,72h细胞生长曲线.上述实验重复三次,取均值.三组间IC50比较采纳采纳方差分析进行.
反义Survivin核酸对MDR1mRNA表达的阻碍上述3组细胞利用Trizol(Takara公司)法提取总RNA,RTPCR法扩增MDR1mRNA,进行比较.MDR1的上、下游引物别离为为:
5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′;5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′,扩增片段412bp.以βactin为内参照(上、下游引物别离为:
5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′;5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′,扩增片段127bp).扩增产物用20g/L琼脂糖电泳,依照条带亮度的不同进行分析.MDR指数:
MDR值/βactin值.三组间MDR指数比较采纳方差分析.
2结果
重组质粒的构建和鉴定利用RTPCR方式从Skov3细胞克隆出Survivin基因,全长451bp,经电泳证明扩增片段与预先设计片段大小一致.与载体以AT策略连接后转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆酶切鉴定,再经上海生工公司测序与基因库中序列完全符合(图1),选取其中与反向连接者命名为antipcDNA3svv.由此取得真核表达载体. 转染后稳固表达反义Survivin细胞克隆的获取阴性转染细胞在G418800mg/L浓度时死亡,阳性转染细胞渐形成单细胞克隆Skov3SVVanti(图2).采纳胰酶定点消化的方式,将单细胞克隆洗脱到25mL细胞培育瓶,进行传代培育,培育成含有antipcDNA3svv的细胞株.
转染antipcDNA3svv对Skov3中Survivin蛋白表达的阻碍Westernbl
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- Survivin 反义 核酸 诱导 卵巢癌 细胞 逆转 耐药 机制 实验 研究
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)