整理苹果茎痘病毒RTPCR检测体系的建立文档格式.docx
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TheresultofRT-PCRsystemcomponentoptimizingwasasfollows:
cDNAtemplatewas0.25µ
L,3'
and5'
primers1.0pmol,dNTP2.5mM,whichcouldshowthebrightestandspecificfragment;
ThePCRprogramisoptimized,theresultwasrTaq2.50U,cyclenumber35.Themostsuitableannealingtemperaturewas57.6℃;
TheRT-PCRproductsweresequenced,thefragmentsizeconsistentwithpublishedDNAsequencewith82%-90%similaritytothepublishedASPVsequence.
Keywords:
ASPV;
Primersscreening;
RT-PCRoptimization
2材料与方法4
3.1RNA质量检测……………………………………………………………………………………………9
3.2RT-PCR内标检测………………………………………………………………………………………10
3.5RT-PCR的产物的测序…………………………………………………………………………………13
4讨论14
4.1苹果病毒病的危害特点:
14
4.2存在问题、最佳防治方法14
4.3RNA提取和病毒扩增引物筛选及RT-PCR检测方法的优化中存在的问题14
4.4展望15
致谢17
1.引言
苹果为世界四大水果之一,分布广泛,具有很高的经济价值[l]。
我国是世界果树起源中心,我国拥有世界最好的适宜产区,国内消费和扩大出口潜力巨大。
我国苹果主要产区包括渤海湾产区、黄河故道和秦岭北麓产区和西北、西南高地产区。
河北省是渤海湾苹果产区的重要省份之一[1],2007年全国苹果种植面积为1961.8千公顷,河北省为250千公顷。
河北省苹果种植面积位居全省果品面积首位[2]。
苹果病毒病是苹果生产的大敌,苹果感染病毒后会严重影响果树的生长,降低产量、品质、果品的贮藏性和耐运力,也影响苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用[3]。
苹果病毒根据危害特点分为非潜隐病毒(Non-Latentvirus)和潜隐病毒(Latentvirus)两大类。
目前世界上报道的苹果病毒病有39种,其中非潜隐性病毒25种,潜隐性病毒14种[4]。
国外自本世纪40年代开展了对苹果病毒病的研究,目前国外主要苹果生产国基本上实现了苹果的无毒化栽培。
我国对苹果病毒病的研究起步较晚,1978年从国外引进病毒指示植物才开始对苹果病毒病进行系统研究,目前已鉴定明确了我国苹果主产区病毒病的种类、分布,并在病毒检测方面取得了很大进展。
1.1我国苹果病毒病种类及分布
我国苹果病毒病已鉴定明确的苹果病毒17种,主要发生的有6种,分别为:
苹果花叶病毒(Applemosaicvirus,ApMV)、苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid,ASSVd)、苹果绿皱果病毒(Applegreencrinklevirus,AgrCV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)、苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV),前三种属非潜隐性病毒,后三种为潜隐性病毒[5]。
苹果花叶病和苹果锈果病在全国各苹果产区均有发生;
苹果绿皱果病仅在河南、甘肃、陕西、辽宁等地有报道;
苹果潜隐性病毒发生普遍,国内目前的苹果主栽品及砧木普遍带有病毒,带毒率一般为60%-80%,有些品种如金冠、红星等品种的带毒株率几乎达100%,且多为复合侵染,复合侵染率为60%-100%[2]。
1.2苹果病毒检测技术研究进展
在当今技术水平下,苹果病毒病尚无有效的防治药剂。
采用脱毒方法,繁殖无病毒苗木,加强病毒检疫,是防治病毒病的唯一途径,我国对苹果病毒病的系统研究起步较晚,自1978年才开始苹果病毒病较系统的研究[6],目前获得了许多品种的无病毒苗,但真正应用到生产实践中的脱毒源种微乎其微,病毒病仍然是导致苹果产量低、品质差,难以取得高效益和占领国际市场的关键因素。
为了获得优良品种的无病毒原种,为苹果生产提供大量无病毒苗木,首先必须建立简单、快速、灵敏、准确的病毒检测技术和鉴定程序。
目前,普遍应用的植物病毒检测方法有:
指示植物生物学检测法、电子显微镜技术、血清学方法、多聚酶链式反应技术。
指示植物检测法仍是国际上通用的一种传统的、经典的检测方法[7]。
其优点是结果准确可靠、直观、简单、不需要仪器、灵敏度较高。
缺点是所需时间较长,占用土地较多,费用较高,检测速度慢。
在检测少量样品本时比较适用,不适于大量样品的常规检测;
电子显微镜技术广泛应用于植物病毒的检测和研究,它能直接观察到病毒粒子的形态特征,其优点就是快速直观、灵敏度很高,但有些病毒在形态上非常相似,鉴定时很难区分,且电镜成本高,不适合多个样本处理,难以在实际生产中普及;
血清学方法快速简便,结果易判断,应用最为广泛[8,9]。
但是植物病毒抗血清的应用有限制性[10]:
首先,不是所有的植物病毒在目前都能制成抗血清,苹果茎沟病毒、苹果褪绿叶斑病毒已具有有效的抗血清[11],多数果树病毒还没有制备出抗血清。
其次,苹果病毒的血清学检测受季节限制,刘新等实验表明在夏季气温较高时没有有效的材料用来进行苹果褪绿叶斑病毒的血清学检测[12]。
近年来,聚合酶联式反应(PCR)在植物病毒检测上得到了迅速的推广和应用。
它具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测速度快捷、对检测样品要求较低等特点,在果树上,RT-PCR已被用来检测李痘病毒,草莓卷叶病毒、梅矮化病毒、苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒、苹果褪绿叶斑病毒等[13-16],近几年,我国也开始了用RT-PCR法检测果树病毒研究[17-20],但与国际上存在很大距离。
苹果病毒在苹果组织中的含量很低,常不易检测出来[21];
而且,病毒常复合侵染,这为生物学检测和血清学检测增加了难度。
PCR技术在病毒浓度很低或同时检测多种病毒时与其它检测方法相比存在着比较突出的优势,己有许多研究证明PCR检测水平可达到fg[22],采用PCR技术对苹果病毒的检测具有广阔的应用前景。
但是由于苹果组织内含有多糖、多酚类物质,导致传统的RNA提取方法或生物公司的某些试剂盒提取苹果的总RNA在质量或产量上往往达不到分子生物学研究的要求。
因此,RNA提取质量差大大限制了苹果病毒病分子检测技术的发展。
1.3研究的目的及意义
采用脱毒方法,繁殖无病毒苗木,加强病毒检疫,是防治病毒病的唯一途径。
很多国家已经实现了苹果的无毒化栽培。
我国对苹果病毒病的研究起步较晚,真正应用到生产实践中的脱毒源种微乎其微。
目前我国已明确了苹果主产区病毒病种类,揭示了主要病毒的部分特性,并在病毒检测方面取得了一定的进展,但由于果树病毒在树体中含量低、分布不均、病毒分布受外界因素影响大、果树中含有多糖多酚等限制因素,真正能够应用到田间的准确、灵敏、快速的检测技术还有待进一步完善,而且病毒本身性质导致病毒分子变异迅速。
2材料与方法
2.1试验材料
2.1.1毒源材料
自保定、石家庄、邢台、秦皇岛、唐山及张家口等地采集的疑似苹果病毒病样品。
-70℃保存备用或试管苗(ACLSV+ASGV+ASPV)继代培养备用。
2.1.2引物设计
参照Candress(1998)[23]序列设计引物,由上海生物工程技术服务有限公司合成。
同源引物为ASPV360-F5’caaccgagaggttggca-3’;
互补引物为ASPV360-R5’-ttctagcaggtcttcatcga-3’。
参照Menzel(2002)[24]报道的苹果内源基因nad5特异性条带的扩增,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
同源引物为nad5-F5’-gatgcttcttggggcttcttgtt-3’;
互补引物为nad5-R5’-ctccagtcaccaacattggcataa-3’。
2.1.3主要试剂及仪器
1)酶及生化试剂
M-MLVReverseTranscriptase、rTaq、RRI、DNAMarkerDL2000dNTPs均为大连宝生物产品;
DEPC、Tris酚、Tris、琼脂糖均为上海生工产品;
RNAPlant植物总RNA提取试剂购于保定市赛尔克生物技术有限公司;
氯化钠、氯仿、β-巯基乙醇、无水乙醇、异丙醇等购于保定万科;
2×
ESTaqMsterMix购于北京康为世纪有限公司。
2)主要仪器
PCR仪、冷冻离心机、紫外透射仪、紫外可见分光光度计、电泳仪、电泳槽、培养箱、干燥箱、高压蒸汽灭菌锅。
2.2试验方法:
2.2.1苹果病毒病样品总RNA提取方法
(1)创造无RNA酶的环境
RNA提取必须创造无RNase的环境,所有枪头、研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等都要用DEPC处理,然后湿热灭菌40min,之后枪头在80℃烘干1-2h;
溶液都需用经DEPC处理过的水配制;
电泳槽、胶板及梳子等也用DEPC处理过夜或是用洗涤灵清洗干净后晾干备用;
实验室要打扫干净,用75%乙醇清洁实验台和地面;
实验操作过程中戴上一次性手套和口罩。
(2)苹果总RNA提取
1)RNA提取改良方法:
参考李玲(2008)[25]报道的方法略做修改。
取不多于0.1g的新鲜叶片,在液氮中迅速研磨,加0.5mL提取试剂(RNAplantplusreagent,4℃),振荡至彻底混匀;
室温放置5min,注意平放离心管,使表面积最大;
4℃12,000rpm离心lmin,取上清转入新的无RNase离心管;
加入0.lmL5MNaCl,温和混匀;
加入0.3mL氯仿,上下颠倒混匀45-60次;
4℃12,000rpm离心10min,取上层水相转入新的无RNase离心管;
加入与所得水相等体积的异丙醇,混匀,室温放置10min;
4℃12,000rpm离心10min,弃掉上清,注意不要倒出沉淀,加lmL75%乙醇;
4℃5000rpm0离心3min倒出液体,注意不要倒出沉淀,剩余的少量液体用头吸出,室温晾干2-3min;
加20-40μL无RNase水,混匀,充分溶解RNA,如有絮状物可在室温条件下12,000rpm离心1min,取上清液转入干净的无RNase离心管中,-70℃保存3.RNA提取质量的检测
1)RNA完整性的检测:
取2μL总RNA样品与0.5μL6×
loadingbuffer混匀点样于1%琼脂糖凝胶上,在110V电压下,电泳25min,EB染10min,观察RNA条带,若出现清晰的28S,18S,5S条带,并且28S条带亮度为18S条带亮度2倍,说明提取的RNA较为完整。
2)RNA纯度的检测:
通过0D260/0D280来检测RNA纯度,0D260/0D230作为参考值。
0D260/0D280值在1.9-2.1之间,可认为RNA的纯度较好;
若比值小于1.8说明提取的总RNA杂蛋白、多糖和酚等污物的干扰较多;
0D260/OD280值大于2.2,则证明RNA已降解。
3)苹果内源基因nad5特异性条带的扩增:
通过引物nad5-F和nad5-R(如图1所示)扩增苹果内源基因nad5特异性条带,如果扩增出181bp条带说明苹果组织总RNA已经提取成功,而且条带亮度越大说明提取的RNA量越大。
图1内源基因nad5引物在序列中的位置
2.2.2.苹果茎痘病毒扩增引物的筛选
根据已经发表的五种病毒的序列,选择保守性区域设计特异性引物,引物设计和序列比对采用VectorNTIversion9.0软件(Informax,Frederick,MD,USA)。
已发表的序列信息包括苹果褪绿叶斑病毒:
NC001409,AJ243438,M58152,AJ243438D14996,X99752;
苹果茎痘病毒:
NC003462,D21829,D21828;
苹果花叶病毒:
NC003465,NC003464,NC003480、U15608,L03726,S78319;
苹果茎沟病毒:
AB004063,D16368,D14455,AF233298,AF233299,D14995,NC001749;
采用自行设计的引物与已发表引物分别进行RT-PCR检测,参照Menzel(W.Menzel,JournalofVirologicalMethods2002,99:
81-92.)方法,采用阳性试材,对引物进行筛选。
(1)苹果茎痘病毒的引物序列[26]
表1ASPVRT-PCR检测筛选引物
引物名称
序列(5’-3’)
片段位置(nt)
片段大小
参考文献
2002ASPV-3'
(w)
TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA
9211-9238
360bp
自行设计
ASPV-5'
TGGAACCTCATGCTGCA
8878-8894
ASPV-3'
(X)
366bp
W.Menzel,2002
ATGTCTGGAACCTCATGCTGCAA
8873-8895
(Y)
TGCCTCAAAGTACACCCCTCAGT
8827-8849
316bp
Jelkmann,1994
CGCCAAGAAATGCCACAGC
8534-8552
ASPV-3(Z)
ATAGCCGCCCCGGTTAGGTT
9237-9256
264bp
Jelkmann,1997,
(Z)
CTCTTGAACCAGCTGATGGC
8993-9012
2002nad5-3'
CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA
1973-1995
181bp
W.Menzel,2002
2002nad5-5'
GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT
968-986,1835-1838
(2)ASPVcDNA合成
特异引物与病毒基因组RNA单链模板结合,在反转录酶的催化下,合成互补DNA(cDNA)。
取dNTPs、DEPC水、互补引物ASPV360-R、总RNA模板、M-MLV、反转录Buffer(10×
)、RNaseInhibitor于1.5mL的Eppendorf管中混匀,按下列体系进行反转录:
第一步:
模板RNA6μL
引物(20pmol)2μL
DEPC处理的超纯水4μL
共12μL
70℃保温10min后迅速冰上冷却2min以上。
离心数秒聚集于Microtube管底部。
在上述Microtube管中配置下列反转录体系
第二步:
上述反应液12μL
5
M-MLVBuffer4μL
dNTPs(10mM)1μL
RNaseInhibitor0.5μL
M-MLV1μL
DEPC处理的超纯水1.5μL
共20μL
将上述体系液于42℃保温1h。
70℃灭活15min后冰上冷却。
将上述液于离心机中离心数秒,使得管中溶液聚集于Microtube管底部。
(3)ASPV特异性条带PCR扩增
以cDNA为模板,以dNTPs为底物,在TaqDNA聚合酶的催化下,进行cDNA的PCR扩增。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察电泳结果并照相记录。
在0.2mLPCR反应管中加入如下成分:
cDNA4μL
dNTPs(10mM)4μL
ASPV5’引物0.5μL
ASPV3’引物0.5μL
10
PCRBuffer2.5μL
ddH2O13.25μL
rTaq(5U/μL)0.2μL
总体积25.0μL
PCR程序为:
94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min,4℃保存。
2.2.3PCR体系的优化
(1)以以下PCR体系及程序为基础,其它条件相同的情况下,对PCR体系和程序的各个条件分别进行优化:
基础体系:
在0.2mL离心管中加入如下成分:
cDNA0.25μL
dNTPs4.00μL
5’Primer1.00μL
3’Primer1.00μL
10×
PCRBuffer2.50μL
rTaq0.25μL
ddH2O16.00μL
总体积25.0μL
94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min。
25μLPCR体系各成分优化如下:
1)cDNA模板浓度:
4μL,2μL,1μL,0.5μL,0.25μL
2)dNTP浓度:
对5mM,2.5mM,1.25mM,0.625mM,0.312mM对dNTPmixtrure进行筛选;
3)引物浓度:
包括2.0pmol/µ
L,1.0pmol/µ
L,0.5pmol/µ
L,0.25pmol/µ
L,0.125pmol/µ
pmo引物;
4)DNA聚合酶浓度的测试:
测试0.50U.75U,1.00U,1.25U,1.50U,1.75U,2.00U的聚合酶浓度;
PCR程序优化条件如下:
l)退火温度:
引物设计软件建议的最佳退火温度为基准,设48.0℃、49.1℃、51.9℃、54.7℃、57.6℃。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,鉴定其亮度和特异性,确定适宜的退火温度。
2)循环次数:
包括30,35,40,45个循环。
3)PCR延伸时间:
根据扩增片段的大小,选定最佳的延伸时间,以0.5min梯度增减时间PCR条件优化。
2.2.4反应产物的电泳检测
扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳,电泳缓冲液用5×
TBE,电压5V/cm。
用伯乐公司生产的凝胶成像系统检测并保留结果。
3结果与分析
3.1RNA质量检测
取2μLRNA样品与0.5μL6xloadingBuffer混匀点样于1.2%的琼脂糖凝胶上,缓冲液为1xTAE缓冲液,120V恒压电泳25min后经EB染色10min,在紫外灯下观察RNA条带,检查总RNA的完整性并照相记录。
图2RNA凝胶电泳图
图中M=Marker,1~5号泳道分别为2010年12月采集的韧皮部(0-5cm,5-10cm,10-15cm,15-20cm,20-25cm)样品
3.2RT-PCR内标检测
不论健康还是染病样品,当RNA完整时,nad5均可扩增出181bp片段,可以用于排除假阴性,作为检测RNA完整性的对照。
当RNA降解或处于抑制状态,或者有DNA污染时,nad5片段不出现。
所以nad5基因的181bp特异性片段可作为RT-PCR内标。
M12345
图2内标nad5基因特异性条带的扩增
M=marker,1和2号泳道为植物总RNA;
3和4号泳道为经DNA酶处理的总RNA;
5号泳道为未经反转录的总RNA
3.3苹果茎痘病毒扩增引物筛选
本实验根据电泳结果决定最佳引物,分别对
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