原核诱导表达.docx
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原核诱导表达
原核诱导表达的标准操作程序(SOP)
一.目的:
使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。
二.适用范围:
本SOP适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。
三.实验原理:
E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。
I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。
由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。
在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。
此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。
当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。
在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
四、试剂准备:
(一)实验器材的灭菌:
枪头的灭菌:
1mL,200µL,20µL的枪头放入枪头盒,用报纸包住(2层),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。
80℃烘箱中烘干,常温放置。
螺口管及离心管的灭菌:
将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中(盖子要拧松,离心管的管盖打开),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。
80℃烘箱中烘干,常温放置。
50mL离心管的灭菌:
将50mL离心管用报纸包住(2层),放入高压灭菌锅中灭菌,121℃,20min。
80℃烘箱中烘干,常温放置。
(二)LB培养基的配制
液体LB培养基(1L):
蛋白胨10g
氯化钠10g
酵母提取物5g调PH值到7.5,高压灭菌,4℃保存。
固体LB培养基(1L):
蛋白胨10g
氯化钠10g
酵母提取物5g
琼脂粉15g
高压灭菌,不烫手的情况下加入抗性,抗性:
培养基=1:
1000(氨苄,卡那通常浓度),混匀。
马上在无菌操作台中倒平板,并开大风吹干。
用封口膜封住,倒置放于4℃保存。
(三)1MIPTG的配制:
经过计算,10gIPTG可以配42ml的1MIPTG。
买来的粉末状的IPTG一般全部配成1MIPTG。
1、无菌操作台紫外线照射,后通风。
2、用少量去离子水将IPTG溶解完全,并定容。
3、在无菌操作台中,用0.22µm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中,过滤除菌,-20℃保存。
注意事项:
在用滤器将IPTG滤入离心管时,先用针头吸IPTG,然后将枪头拔掉,排出气体,滤头加入IPTG液,在使针管与滤器相连,保证整个装置无气体进入。
滤的过程中,手不能碰滤头。
(四)3×SDS-PAGEloadingbuffer的配制:
3×SDS-PAGEloadingbuffer
10ml
1MTris-Hcl(PH6.8)
1.5ml
SDS
0.6g
BPB(溴酚蓝)
30mg
甘油(丙三醇)
3ml
去离子水
5.5ml
1.将除BPB以外的药品完全溶解。
SDS常温下很难溶解,可以在37℃水浴溶解。
完全溶解后,再加入BPB,进行溶解。
2.把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中,1ml/管,常温放置。
3.使用前,每管加入30µL巯基乙醇。
注意事项:
巯基乙醇为危险品,加入的过程在通风橱中完成,并且带好手套。
(五)10×PBS的配制:
0.1MPBS(10×PBS)
1L
NaH2PO4.2H2O
2.83g
Nacl
85g
Na2HPO4.12H2O
28.98g
用去离子水将以上药品进行溶解。
(溶解的非常慢,可能需要过夜)
调PH值到7.2,用0.4µm的滤膜过滤。
常温保存。
工作时用的是1×PBS。
(六)1.5MTris-Hcl(PH8.8)的配制:
1.5MTris-Hcl
250ml
Tris
45.425g
1.用200ml去离子水将Tris溶解。
2.用浓盐酸调PH值到8.8。
3.调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。
4.0.4µm的滤膜过滤,常温保存。
注意事项:
Tris的缓冲能力很强,调PH值时,费些时间,但不要调过。
(七)1MTris-Hcl(PH6.8)的配制:
1MTris-Hcl
250ml
Tris
30.275g
1.用200ml去离子水将Tris溶解。
2.用浓盐酸调PH值到6.8
3.调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。
4.0.4µm的滤膜过滤,常温保存。
(八)30%丙烯酰胺的配制:
30%丙烯酰胺
250ml
丙烯酰胺
72.5ml
BIS甲叉丙烯酰胺
2.5ml
1.把药品用去离子水溶解后定容到250ml。
2.用滤纸过滤,放在棕色瓶子中,4℃保存。
注意事项:
两种药品有毒性,配制过程要带手套和口罩。
(九)10%SDS的配制:
1.1gSDS加入10ml去离子水进行溶解。
2.分装到1.5ml离心管中,-20℃保存。
(十)10%过硫酸铵的配制:
1.1g过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。
2.分装到1.5ml离心管中,-20℃保存。
(十一)5×SDS-PAGE电泳缓冲液的配制:
5×SDS-PAGE电泳缓冲液
1L
Tris
15.1g
Glycine(甘氨酸)
94g
SDS
5g
将以上药品用去离子水溶解后定容到1L,常温保存。
工作时用的是1×SDS-PAGE电泳缓冲液。
(十二)考马斯亮蓝R-250染色液的配制:
考马斯亮蓝R-250染色液1L
1.往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇,在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。
2.加入650ml去离子水,磁力搅拌器搅拌过夜。
3.再加入100ml冰醋酸进行溶解,磁力搅拌器搅拌。
4.在通风橱内用滤纸进行过滤。
常温保存。
染色液只能反复用两次。
注意事项:
在磁力搅拌器上搅拌时,要把容器封口。
(十三)脱色液的配制:
脱色液
1L
醋酸(冰乙酸)
100ml
乙醇(无水乙醇)
50ml
去离子水
850ml
常温保存。
四.实验步骤:
(一):
质粒的转化
1.使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭,然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上,在开紫外照射30min左右。
操作之前,关掉紫外,打开通风橱,将手用酒精擦拭后开始操作。
2.从-80℃的冰箱中取出表达菌(BL21)的感受态细胞(每管100µL),在-80℃冰水中融化。
3.载体(PET32a等)与基因片段的连接后质粒1µL,缓慢的加入到100µLBL21感受态中,冰置15min。
(无菌操作)
3.42℃下热激90s,随后在冰水中冰置5min。
4.涂板:
先将涂布棒用酒精棉球擦,然后用酒精灯火焰烧,放置等它凉却。
把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基(氨苄或卡那等)上。
用冷却的涂布棒进行涂布,左手把该盖拿起,小指轻轻转动培养基,右手来涂,涂到培养基表面快干。
(无菌操作)
5.放在37℃培养箱中,倒置培养过夜。
注意事项:
1.质粒的转化时,质粒是冻在-20℃的冰箱中,等它完全化了在进行吸取,往感受态中加入质粒时,一定要缓慢,因为感受态非常脆弱,防止感受态受伤。
2.质粒的转化时,热激的时间90s,一定要控制好时间。
3.质粒的转化时,涂布棒在涂布前,一定要晾凉涂布棒。
防止感受态被烫死,或固体培养基的损坏。
(二):
挑菌与接菌:
1.无菌操作台紫外线照射,后通风。
将转化后的平板取出。
2.在无菌操作台中,把消毒后的螺口管(一般一个基因取四个螺口管,进行平行实验)取出,在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。
3.灭菌后的LB培养基从冰箱中取出,在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。
吸取LB培养基(一般5.5mL)加入螺口管中,后加入抗性(氨苄霉素、卡那等)。
氨苄霉素(卡那):
LB培养基=1:
1000(5.5µL),抗性由载体决定。
4.镊子用酒精棉球擦拭,并在酒精灯的外焰上灼烧,将镊子晾凉。
用晾凉的镊子,夹取20µL小枪头,在转化后的平板上挑取单菌落,扔到培养基中。
5.接好菌的螺口管,进行摇菌。
37℃,180rpm。
摇到菌的对数期(OD600值0.4-0.6),时间大概2-3h。
可以模糊看到手即可。
(注意不要摇过)
6.用完的平板用封口膜封住,倒置放于4℃保存。
7.若直接用菌液进行接菌,接菌比例为,菌液:
LB培养基=1:
100。
注意事项:
1.接菌吸培养基时,把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基,移液枪尽量不要插进三角瓶中。
2.接菌时一定要加入抗性,挑菌落时,要挑单个的菌落,且不要把培养基也扣起来。
3.摇菌不要过了它的对数期,2小时后随时注意其生长状态。
(三)小量保菌:
1.无菌操作台紫外线照射,后通风。
2.将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌,先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。
3.保菌:
从灭菌的饭盒中取出4个1.5ml的灭菌的离心管,加入50µL的灭菌后的80%的甘油,并分别加入相应的350µL菌液。
一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。
(若不保菌,实验不能进行重复,只能从头做)
4.标清保菌的类别,名称,时间,如“BL21PET32aVAV1号2010.7.14”,其中的1号是平行对照中它排几号。
5.混匀,-20℃保存。
注意事项:
1.在小量保菌中,一个基因的四个平行对照都要保菌,否则得重新摸条件。
2.在小量保菌中,菌液与甘油一定要混匀在保存,否则菌会被冻死。
(四)蛋白诱导表达条件摸索
1.无菌操作台紫外线照射,后通风。
2.小量保菌后的四个平行实验组,分别加入不同终浓度的IPTG,在不同的温度条件下进行诱导(如下图):
对照编号
IPTG终浓度
诱导温度
诱导温度
1号
1mmol/L
3h
37℃
2号
0.1mmol/L
3h
37℃
3号
1mmol/L
3h
30℃
4号
0.1mmol/L
3h
30℃
(五)小量收菌
1.将诱导完成的四个平行实验组菌液,分别取出1mL,对应装于4个不同的1.5ml离心管中并做好标记。
剩余的平行实验组菌液放入4℃保存。
2.离心7000rpm,2min,使菌沉淀。
3.把上层培养基倒掉,用1ml1×PBS把表达菌重悬,再次离心7000rpm,2min,使菌沉淀。
4.把上层1×PBS倒掉,再次离心同步骤3。
5.用80µL1×PBS把表达菌体重悬。
6.在四个平行的重悬液中,分别加入80µL3×SDS-PAGEloadingbuffer。
(把3×SDS-PAGEloadingbuffer当成2×SDS-PAGEloadingbuffer用)
7.煮样8min。
(打开锅盖煮)
8.离心13000rpm,10min。
吸上清。
9.进行SDS-PAGE电泳。
注意事项:
在煮样时要打开锅盖煮,防止小样进水,若样进水,则不能再用。
(六)SDS-PAGE胶的配制
1.分离胶的配制
(1)找出配套的胶板,用擦镜纸擦干净,并固定在配胶器上。
随后用去离子水试漏。
(2)若胶板不漏水,就进行分离胶的配制。
依次将水、30%丙烯酰胺、1.5MTris-Hcl(PH
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