肺炎链球菌转化模型的成立Word格式文档下载.docx
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10-3%,±
10-3%],构建了肺炎链球菌感受态缺点菌株,成立了改良的肺炎链球菌实验室转化模型.结论:
改良的转化模型实现了稳固的肺炎链球菌实验室转化,能方便研究者对该菌进行各类遗传操作,为深切研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
【关键词】肺炎链球菌;
转化,细菌;
感受态
【Abstract】AIM:
ToestablishatransformationmodelofStreptococcuspneumoniaeinlaboratorytopromotethetransformationefficiencyandreconstructitschromosomegenebyimprovingtheprevioustransformationmethod.METHODS:
Thecompetencecellsofwerepreparedusingboththepreviousandimprovedmethods.AftertheexoticDNAwastransformedundercertaincelldensity,thetransformedcoloniesonantibioticplate,whichwasidentifiedbygrowinginantibioticscultureandPCR,werecountedtocomparetheirtransformationrate.RESULTS:
Theimprovedtransformationmodelofinlaboratorywasestablished.Thetransformationrateof334was(±
)%and31203was(±
)%undertheimprovedtransformationmodel,whichwasrelativelyhigher.Usingthismodel,weconstructed4competencedefectivestrains.CONCLUSION:
Inlaboratory,theimprovedtransformationmodelcanraisethetransformationrateof,whichinducesdifferentintocompetence,andprovidesaresearchtechnologyforfurtherinvestigationonpneumococcalpathogenesis.
【Keywords】occuspneumoniae;
transformation,bacterial;
competence
0引言
转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态(特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态),摄取外源性DNA,通过同源重组致使基因发生改变的进程.通过转化能够改造细菌基因,进行功能基因组研究,它是研究肺炎链球菌()生物学功能的重要手腕.本课题组既往的实验室转化模型[1]有两大短处:
一是转化效率不稳固;
二是感受态开放时刻较短,不能知足大规模转化的需要.有研究[2]以为冷刺激可能会延长感受态开放时刻,咱们据此对既往转化模型进行改良,即冷冻处置细胞后再做转化,以期克服其短处.
1材料和方式
材料血清4型标准菌株TIGR4(ATCCBAA334),干粉(美国ATCC微生物菌种保留中心);
血清3型标准菌株CMCC(B)31203,干粉(中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保留中心);
SⅡ型(1和2号菌株)由中国医科院提供;
要紧遗传特点经鉴定合格.C+Y培育基:
含5g/LYeast提取物(LacksandHotchkiss,1960);
TSA血平板:
含50mL/L兔脱纤维全血.感受态刺激因子(CSP2)由挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠;
CP1250的染色体DNA(含有链霉素抗性基因str)由美国Morrison教授惠赠;
1d菌株的基因组DNA(含红霉素抗性基因erm的comE断裂基因)由本课题组构建[3];
DNA提取试剂盒(上海华舜公司);
牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司);
胰蛋白胨、大豆蛋白胨(Gibco公司).722分光光度仪(上海仪器分析三厂);
-80℃低温冰箱(日本SANYOMedicalfreezerMDF330型).
方式
的生长曲线绘制挑取单个菌落接种于C+Y培育基,37℃培育12h,转接于20mLC+Y培育基中,于37℃水浴孵育,从1h后开始在分光光度仪上测菌液A620nm值,以后每隔1h取样1次.以时刻为横坐标,吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.
改良的实验室转化模型的成立
改良的实验室转化模型取冻存于-80℃冰箱的菌株,培育于CTM培育基(含C+Y培育基,1mmol/LCaCl2,g/LBSA)中,37℃水浴至A550nm=左右时,将甘油加入上述菌液中,至其终浓度为100mL/L,分装后冻于-80℃,此即为感受态细胞;
24h后掏出冻存菌液,在冰上融化,9000g离心1min,弃去上清液,加入100μLC+Y培育基(),使沉淀完全悬浮,加入CSP20μg/L,同时加入CP1250的染色体DNA100μg/L,于37℃孵育90min,铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上,于37℃孵箱培育24~48h,即取得转化菌落.
方式学比较取冻存于-80℃冰箱的菌株,别离用上述改良方式和既往方式[1]制备感受态细胞,然后加入CSP220μg/L,并加入CP1250的染色体DNA100μg/L,于37℃孵育90min,铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上,于37℃孵箱培育24~48h,计数抗生素血平板上的转化菌落.转化率=平板菌落数/细菌总数×
100%.其中,细菌总数按A620nm=时,细菌数为5×
1011cfu/L计算.
感受态缺点菌株的制备及鉴定
感受态缺点菌株的制备用上述改良的转化方式制备感受态细胞,然后加入CSP220μg/L,及含comE断裂基因的染色体DNA(即1d菌株DNA)100μg/L,于37℃孵育90min,铺于含mg/L红霉素的TSA血平板上,于37℃孵箱培育24~48h,挑取平板上的转化菌落,接种于含mg/L红霉素的C+Y培育基中,37℃培育增菌,当菌密度为A620nm=左右时,冻于-80℃冰箱保留,即取得缺点菌.
感受态缺点菌株的鉴定鉴定1:
将野生菌和缺点菌同时做转化,选用CP1250的DNA为外源基因.鉴定2:
提取野生菌和缺点菌的染色体DNA,用comE(5′TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3′,5′ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3′)和erm(5′CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3′,5′AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3′)的引物[4]做PCR.加入comE或erm的上、下游引物5μmol/L,加入MgCl2μmol/L,TaqplusDNA聚合酶1U.循环参数为95℃5min预变性;
94℃1min,55℃1min,72℃min,30个循环;
72℃10min.15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.
统计学处置:
依照资料类型采纳t查验,以P&
lt;
为不同有统计学意义(双侧). 2结果
的生长曲线菌株334和31203的生长曲线无明显不同,生长情形大体一致(图1).
图1肺炎链球菌334和31203菌株的生长曲线(略)
改良的实验室转化模型取得334和31203菌株的转化菌株,转化率别离为%和%.方式学比较实验结果显示,菌株334和31203用改良转化模型后,两株细菌的转化率皆比用既往转化模型的转化率高两个数量级,不同有统计学意义(P&
,表1),改良转化模型的转化效率明显优于既往转化模型.
表1肺炎链球菌()334和31203菌株用不同转化模型的转化率比较(略)
aP&
vs既往方式.
感受态缺点菌株的取得利用含comE断裂基因的染色体DNA转化334,31203,1和2号菌,别离取得转化菌落,即为感受态缺点菌,转化率别离为%,%,%和%.鉴定1:
将野生菌和缺点菌同时转化抗链霉素(str)的DNA,野生菌取得转化菌株,而缺点菌无一个菌落生长.鉴定2:
以野生菌和缺点菌的染色体DNA为模板,以comE和erm的引物做PCR,缺点菌别离在1515bp和726bp处有产物,而野生菌那么无这两个片段的产物(图2).
M:
2000bpladderDNAmaker;
1~4:
取得的334,31203,1,2号菌株的感受态缺点菌DNA含有erm基因;
5~8:
取得的334,31203,1,2号菌株的感受态缺点菌DNA含有comE断裂基因.
图2肺炎链球菌感受态缺点菌株(略)
3讨论
是自然界能够发生自然转化的一种条件致病菌,在目前发觉的能够发生自然转化的几种细菌中,的转化率最高[5].转化后可发生基因同源重组,因此仍是基因敲出、基因突变的有利工具,关于细菌功能学的研究很有帮忙,因此咱们需要把握在实验室的稳固、高效的转化模型,以便于对其基因功能和致病机制进行深切研究.的转化受密度感应系统的操纵,当细菌生长到必然密度时,感受态会受到抑制,自然状态下,感受态开放时刻仅十几分钟,因此很难在实验室条件下捕捉到的自然转化.人工纯化合成的CSP能诱导转化,使在实验室转化成为现实.但是既往的转化模型不够稳固,且不适合大量持续的实验室转化,有待改良.的荚膜较厚,会妨碍外源DNA的转入,冷冻处置可能会减弱荚膜的形成,使其转化率增加[6],且有研究以为冷刺激会延长细菌感受态开放时刻,因此咱们在细菌自然生长适合的菌密度时(许多研究以为现在处于自然转化期)冷冻感受态细胞,然后利用CSP进一步诱导转化.
本课题组的前期实验[1]已试探出适合的转化培育基、pH及培育时刻(菌密度)等,咱们通过绘制31203菌株和334菌株的生长曲线,发觉二者的生长情形大体一致,因此对334菌株采纳相同的转化体系和条件.咱们的结果显示,在实验室条件下,运用选定的转化体系和条件,能将外源DNA转入细菌,且改变了细菌的生物学性状,使其产生了抗生素抗性,成功地成立了改良的实验室转化模型.两种菌株采纳改良的转化模型后,其转化率均明显高于既往转化模型,说明冷冻处置感受态细胞能有效提高其转化率;
且改良模型能够一次制备大量感受态细胞,操作简便,可持续利用感受态细胞.因此改良的实验室转化模型相当稳固、高效.
comE是调控感受态的关键基因,各类环境因素对转化发生的调剂都是通过直接或间接方式阻碍comE的表达来实现的[7-8].咱们选用该基因为目的基因,将含comE断裂基因的DNA转入野生菌,取得感受态缺点菌株,实验证明这些缺点菌的确不能发生转化,可用于下一步相关研究.说明能够通过稳固的实验室转化模型,改造那些具有自然转化特性的细菌(如)的各类基因,进而观看细菌发生的转变.采纳这种模型方便了对细菌进行各类遗传操作,为深切研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
致谢美国加州大学Morrison教授惠赠CP1250的DNA,挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠CSP2,在此表示衷心感激.
【参考文献】
[1]孟江萍,尹一兵,张雪梅,等.肺炎链球菌转化模型的成立与优化[J].微生物学杂志,2006,26
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