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3.1麻杏石甘汤中麻黄碱的含量测定方法7
3.1.1色谱条件7
3.1.2标准曲线的制备8
3.1.3供试品溶液的制备9
3.2超声时间对麻黄碱溶出量的影响9
3.3麻杏石甘汤最佳麻黄碱提取体积的测定9
3.4麻黄碱的含量计算11
3.4.1稳定性试验11
3.4.2重复性试验11
3.4.3精密度试验12
3.4.4含量计算12
4.结论12
参考文献13
致谢15
HPLC法测定麻杏石甘汤颗粒剂中麻黄碱的含量
摘要:
目的:
建立HPLC法测定麻杏石甘汤颗粒剂中麻黄碱的含量。
方法:
利用高效液相色谱仪,以乙腈-0.3%磷酸溶液为流动相,梯度流速1.0ml/min,检测波长207nm,测定麻杏石甘汤颗粒剂中麻黄碱的含量。
结果:
42.3824mg/2g麻杏石甘汤颗粒剂。
.结论:
超声60分钟,提取体积为40ml时麻杏石甘汤中麻黄碱的提取量最大,采用HPLC法测定麻杏石甘汤中麻黄碱的含量,方法简便、准确。
关键词:
麻杏石甘汤颗粒剂;
药理作用;
临床应用;
HPLC;
超声时间;
提取体积。
1.引言
1.1简介
麻杏石甘汤源于《伤寒论》,由麻黄、杏仁、石膏、甘草诸药组成,具有辛凉宣肺、清肺平喘的功效。
木方主要治疗外感风热袭肺,或风寒之邪所致肺气闭塞、郁而化热之证。
临床症状有身热不解、咳嗽气急、口渴等,应用木方治疗有较好的疗效。
其中麻黄为君药,取其能宣肺而泄邪热,为“火郁发之”之意。
石膏为臣药,且用量倍于麻黄,使宣肺而不助热、清肺而不留邪,与君药相制为用。
现代研究表明麻杏甘石汤的药理作用十分广泛,对于镇咳、抗炎、抗病毒、调节免疫功能等都具有良好的应用。
临床上已广泛用于上呼吸道感染、鼻窦炎急慢性气管炎、支气管肺炎、等多种疾病治疗。
1.2麻杏石甘汤的主要药理作用
1.2.1解热作用
研究药物对酵母引起大鼠发热的影响。
选取体温止常(37~38.50°
C)的SD大鼠,分别皮下注射10%酵母混悬液10mL/kg,5h后选取体温升高>
0.8℃的大鼠30只,随机分成3组:
高剂量组以麻杏石甘汤4.0mL/kg灌胃,低剂量组以麻杏石甘汤2.0mL/kg灌胃,对照组以生理盐水4.0mL/kg灌胃。
给药1,2,3,4,6h后用肛表插入肛门内2cm,3min后记录肛温(℃)。
将高、低剂量给药组与对照组的肛温比较(t检验)。
结果表明高、低剂量麻杏石甘汤均能明显抑制大鼠发热。
(见表1)
1.2.2抗炎作用
研究药物对巴豆油致小鼠耳壳炎症的影响。
取昆明小白鼠30只,雄性,随机分成3组。
分组与给药剂量与前相同,1次/d,连续3d。
于末次给药O.5h后,每只小鼠右耳背均匀涂巴豆油0.03mL,4h后用微调打孔器凿耳片称重,以左耳作对照,以左右耳重量差为炎症程度指标。
经组间检验,结果显示高、低剂量麻杏石甘汤均能明显抑制巴豆油致耳壳炎症(见表2)。
1.2.3镇咳作用
研究药物对氨水所致小鼠咳嗽的影响。
取昆明小白鼠30只,分组与给药剂量同前。
于末次给药0.5h后,将每只小鼠置于玻璃钟罩内(容量为500mL)罩内放置含25%一28%的氨水0.2mL,随即观察和记录小鼠咳嗽潜伏期和2min内发生咳嗽反应的次数。
经检验,结果显示高、低剂量麻杏石甘汤均能显著延长咳嗽潜伏期,减少咳嗽次数(见表3)。
1.2.4抑菌作用
将培养好的肺炎双球菌以生理盐水稀释为3x10^6个/mL、金黄色葡萄球菌稀释为9x10^6个/mL的菌液,分别注射0.5mL以感染小鼠。
于注射前3d灌胃给药,1次/d,连续5d。
观察小鼠感染后48~72h死亡数,计算死亡率。
与对照组相比,高、低剂量麻杏石甘汤对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌感染致死有显著抑制作用(见表4)。
1.2.5抗病毒作用
取小鼠60只分为两批,每批30只,随机分成3组。
分别以流感病毒、副流感病毒0.1mL滴入小鼠鼻腔,连续3d,第4天灌胃给药,逐日观察给药后3d内动物反应和死亡数。
结果病毒感染后对照组小鼠有竖毛、活动减少等现象,死亡数较多,麻杏石甘汤高、低剂量组死亡数明显减少(见表5)。
1.3麻杏石甘汤的临床应用
1.3.1支气管哮喘
辨证施治哮喘.分辨冷、热及肺、脾、肾虚弱等。
而麻杏石甘汤是治疗热喘之良方。
松日邦夫将哮喘分为4型:
变态反应型、咳嗽不止型、心身症型、虚弱体质型。
其中对于咳嗽不止型治疗建议:
发作期给予麻杏石甘汤.非发作期给予小柴胡汤合麻杏石甘汤。
周耀群以麻杏石甘汤为主方.随症加减治疗47例内源性哮喘病人。
治疗后完全缓解17例.显效13例.有效11例.总有效率达87%。
并且47例病人治疗前后白细胞总数(P<
0.01)与嗜酸粒细胞(P<
0.05)下降具有统计学意义。
治疗前后IgE测量显示IgE下降也具有统计学意义(P<
0.05).李永贵以麻杏石甘汤合葶苈大枣泻肺汤加味治疗支气管哮喘138例.治愈98例.好转23例.总有效率达87.7%尹全真采用麻杏石甘汤与定喘汤加味治疗小儿哮喘60例.治愈40例.好转15例.总有效率达92%.
1.3.2急、慢性支气管炎与支气管肺炎
支气管肺炎属祖国医学“咳嗽”、“喘证”范畴.多因人体止气不足,卫外低下时感受外邪致病。
西医认为支气份炎是由感染、物理、化学刺激或过敏等因素引起的气份一支气管黏膜的急性炎症。
皱凤伦采用银车麻杏石甘汤雾化吸入佐治小儿细菌性支气份肺炎,并以常规抗生素、退热、止咳等对证处理进行治疗对照组比较疗效,治疗组共30例,显效20例,有效9例,总有效率为96.6%,对照组共29例,显效7例,有效18例总有效率为86%,统计学处理治疗组疗效显著优于对照组(P<
0.01)。
曹宁等一采用麻杏石甘汤加味治疗小儿支原体肺炎30例,井以红霉素治疗为对照组进行疗效比较,中医治疗组平均退热时间、咳嗽时间,啰音消失时间、肺部阴影消失时间均明显较对照组缩短.左异均有非常显著性意义朱必泉以麻杏石甘汤玉屏风散为主防治小儿咳喘(支气竹炎).治愈119例.有效81例。
1.3.3心血管疾病
肺心病属祖国医学“咳喘”、“痰饮”、“水肿”等范畴。
其发生发展与肺、心、脾、肾有关。
中医分型为:
寒痰阻肺型、湿痰郁肺型、脾肾两虚型、元阳欲脱型。
周灿等以麻杏石甘汤合千金苇茎汤加减治疗寒痰阻肺型(17例)均取得良好疗效。
杨氏报道以麻杏石甘汤合五皮饮加减治疗46例肺心病伴心力衰竭有效率达84%。
1.3.4肛肠疾病
“诸气者.皆属于肺”.“肺主治节.与大肠相表里”.两者相互为用.相互影响。
周铺健以麻杏石甘汤加味治疗1病人内痔.服药1剂后.痔核肿胀明显减轻.出血减少.服完4剂后.痔核同纳.肿痛消失.大便时不再出血。
刘洪钧以麻杏石甘汤加味治疗1患者脱肛服用7剂后.复诊诊视.脱肛痊愈。
牛治军以麻杏石甘汤加味治疗肛裂并与以复方阿司匹林.1:
1500PP粉坐浴为治疗相对照.治疗组50例.显效46例.有效4例.总有效率为100%.对照组32例.显效8例.有效18例.总有效率为81.25%,统计学处理治疗组疗效显著优于对照组(P<
1.3.5皮肤病
尊麻疹在祖国医学中属“风疹”、“瘾疹”等范畴。
顽固型尊麻疹一年四季均可发生。
病因病机多为素体郁热.复感风热之邪.客于肌肤.或挟湿热.滞而不去.留于肌肤发等。
现代医学认为.该病发病机理与变态反应有关。
郑银采用麻杏石甘汤加味治疗顽固性尊麻疹14例.痊愈12例.显效1例.总有效率为9286%。
银屑病是一种具有特征性红斑鳞屑性慢性皮肤病。
中医称为白沱、松皮癣。
孔繁学运用四物汤合麻杏石甘汤加味治疗1银屑病病人.连续服用20剂.皮疹基木消退.2个月后随访.皮损恢复止常。
韩晓雪采用麻杏石甘汤加味治疗2例神经性皮炎.亦获良效。
1.4麻黄碱简介
麻黄碱,是一种生物碱。
分子式C10H15NO。
麻黄碱是拟肾上腺素药,可以兴奋交感神经,药效比肾上腺素持久。
能松弛支气管平滑肌、收缩血管,有显著的中枢兴奋作用。
临床主要用于治疗习惯性支气管哮喘和预防哮喘发作,对严重支气管哮喘病人效果则不及肾上腺素。
2.实验材料
2.1实验仪器
以下是本实验中用到的主要仪器及其型号:
表1仪器与型号
仪器型号来源
圆底烧瓶江西科技师范大学
回流冷凝管江西科技师范大学
抽滤瓶江西科技师范大学
高效液相色谱仪依利特大连依利特分析仪器有限公司
智能恒温电热套HH-8江苏金坛荣华仪器制造有限公司
双频数控超声波清洗器KQ-200VDE昆山市超声仪器有限公司
隔膜真空泵GM-0.33Ⅱ天津津腾实验设备有限公司
微量进样器平头-25uL宁波市镇海三爱仪器厂
电子天平BS224S雷多利斯科学仪器有限公司
2.2实验试剂
以下是本实验中用到的主要试药及其来源:
表2试药与来源
试药
规格
来源
苦杏仁苷对照品
中国药检所
麻黄
下罗药店
杏仁
药分实验室
石膏
甘草
磷酸
500ml分析纯
天津市福晨化学试剂厂
甲醇
500ml色谱纯
西陇化工股份有限公司
液相用水
南昌市娃哈哈食品有限公司
3.实验方法
3.1麻杏石甘汤中苦杏仁苷的含量检测
不同超声时间麻杏石甘汤中麻黄碱的含量测定方法主要有高效液相色谱法和紫外分光光度法。
其中高效液相色谱法操作简便、重复性好、准确、灵敏度高,因此本实验运用高效液相色谱法测定麻杏石甘汤中麻黄碱的含量。
3.1.1色谱条件
色谱柱:
依利特ODS2(4.6*150mm,5µ
m)
流动相:
甲醇-0.3%磷酸(98:
2)
流速:
1.0ml/min
柱温:
常温
检测波长:
207nm。
理论塔板数不少于3000.
3.1.2标准曲线的制备
分别精密吸取5µ
L,7.5ul,10µ
L,15µ
L,20µ
L,,麻黄碱对照品溶液进样,按上述色谱条件测定,记录出峰时间,对照品溶液所得色谱图见图1。
图1..麻黄碱标准品10ul
由麻黄碱标准溶液色谱图中我们可以发现,麻黄碱对照品的出峰时间是16min左右。
因为对照品溶液中有麻黄碱和伪麻黄碱,所以进一针伪麻黄碱对照品,图谱如下:
图2.伪麻黄碱标准品15ul
由上图可知伪麻黄碱的出峰时间是18min左右,所以之后的读谱18min左右出的峰认为是目标物质麻黄碱,且要尽量让麻黄碱和伪麻黄碱分开(利用流动相甲醇-0.3%磷酸(98:
2)可以将二者完全分离),以免误读。
测得制作麻黄碱标准曲线所需的五点数据如下表。
进样体积(µ
L)
5
7.5
10
15
20
峰面积(麻黄碱)
3662.87
14858.1
6321.42
8720.48
12012.45
进样量(ug)
1.175
1.7625
2.35
3.525
4.7
由此五点制得标准曲线如下:
图3.麻黄碱对照品标准曲线
3.1.3供试品溶液的制备
取麻黄9g,杏仁9g,甘草6g,石膏18g。
精密称定,置圆底烧瓶中,加入纯净水420ml,控制其至微沸加热回流1h,然后趁热抽滤,滤渣加420ml纯净水再次微沸一小时抽滤,两次的滤液合二为一再进行蒸发。
快蒸干之时加入到蒸发皿中,放入设置温度为105°
C的烘箱中1小时,烘干磨粉过80目筛网与等量淀粉混合,加60%乙醇少许制软材,最后过筛网制得供试品麻杏石甘汤颗粒剂。
3.2不同超声时间麻杏石甘汤中麻黄碱的含量对比
精密吸取5种超声时间下的待测供试品溶液10µ
L,注入高效液相色谱仪,测定,结果如下表所示:
不同超声时间麻杏石甘汤中麻黄碱的含量
超声时间(min)
30
40
50
60
麻黄碱峰面积
2599.10
5600.56
8501.26
11023.10
12167.21
从上表可以看出,超声在60min时,麻杏石甘汤中麻黄碱的含量最大。
其色谱图如下
超声60min供试品色谱图
3.3麻杏石甘汤最佳麻黄碱提取体积的测定
根据推算,最优提取体积P=KSV(k常数,s峰面积,v进样体积)
V(提取体积/ml)
S(峰面积)
2839.98
3205.68
4366.23
2365.5
2530.06
由表可知,最优提取体积为40ml
提取40ml供试品色谱图
3.4麻黄碱的含量计算
3.4.1精密度实验
取麻黄碱标准品,一次进样5针,每针10µ
L,测得结果如下表:
表5精密度测试峰面积
进样次数
保留时间(min)
峰面积(mv.sec)
1
16.23672
6341.42
2
16.17854
6344.21
3
16.11234
6343.75
16.31456
6360.62
16.41231
6356.35
通过公式:
RSD=SD/X*100%
SD=
计算结果RSD=0.128%,由此说明精密度良好。
3.4.2稳定性实验
取超声60min,40ml最优体积供试品,分别在放置0、2h、4h、6h、8h后进样各一次,每次10µ
L,测得苦杏仁苷的含量如下表:
表6稳定性测试峰面积
进样时间(h)
16.46456
3266.84
16.24654
3255.25
16.35452
3243.98
6
16.37979
3201.82
8
16.60467
3195.36
通过公示:
计算结果RSD=0.996%,由此说明稳定性良好
3.4.3重复性实验
取1超声60min,40ml最优体积供试品,分别进样6针,每针10µ
L,测得麻黄碱的含量如下表:
表7重复性实验测试峰面积
16.13134
3261.45
16.87971
3266.78
16.36649
3265.65
16.46473
3260.60
16.13198
3258.32
SD=
计算结果RSD=0.1098%,由此说明重复性良好。
3.4.4含量计算
峰面积:
根据线性方程:
y=2345.0X+777.82将平均供试品峰面积3262.48带入
求得浓度为10.5956µ
g/10µ
L
麻杏石甘汤颗粒剂质量:
2.0g
所以每两克麻杏石甘汤颗粒剂中含有麻黄碱含量为42.3824mg/2g麻杏石甘汤颗粒剂。
4.结论
本实验采用HPLC法测定不同超声时间和提取体积麻杏石甘汤颗粒中麻黄碱的含量,超声时间在60min时,麻杏石甘汤颗粒剂中麻黄碱的含量相对较多,达到42.3824mg/2g麻杏石甘汤颗粒剂。
通过本实验建立了HPLC测定麻杏石甘汤颗粒剂中麻黄碱含量的方法,其精密度良好,稳定性良好,重现性良好,且该方法简便快捷,准确易操作,适合本次实验。
参考文献
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DeterminationthecontentofephedrineatMaxingShiganTanguseHPLC
ShiganTanguseHPLC
Abstract:
Todeterminethecontentofephedrinein“MaxingShiganDecoction”.UsingHPLCwithmethylalcohol-0.3%phosphoricacidasthemobilephase,gradientflowrateis1.0ml/min,detectionwavelengthof207nm,measuredthecontentofephedrinein"
MaxingShiganDecoction"
ofdifferentultrasonicsoundtimeanddifferentextractionvolume.Theresultsshowedthatthecontentofephedrinereacheditshighestwhentheultrasonicsoundtimeof“MaxingShiganDecoction”was60min,andextractionvolumewas40ml,whichwashigherthananyotherconditions.ThisimpliesthatusingHPLCtodeterminethecontentofephedrinein“MaxingShiganDecoctionisaccurateandeasytooperate,andalsoprovidesmethodandbasisforfurtherstudyof“MaxingShiganDecoction”.
KeyWords:
“MaxingShiganDecoction”;
ephedrine;
ultrasonicsoundtime;
extractionvolume;
Determination;
HPLC
致谢
时光荏苒,不知不觉即将大四。
在当下鼓励提前完成毕业设计实验的方针引导下,我找了周斌老师,并且成功成了他的小跟班之一,这挺幸运的。
我完全认同,毕业论文就是大学生活最后的句号,所以,在做毕业设计的这段时光里,我倍感珍惜。
怀着对以往的实验点点滴滴的好的坏的记忆,但在此刻看来都是美好的,因为我并不知道自己是否还有机会回到这里。
2015.5.25-2015.6.3日我完成了所有实验部分的工作,为了避免数据遗失和操作过程的记忆的遗忘,我于2015.6月提前完成了毕业论文的撰写工作。
我的毕业论文从最初的定题,到资料收集,到写作、修改,再到论文定稿的整个过程,周斌老师和李梦洁学姐给了我莫大的指导和悉心的帮助,在此我表示衷心的感谢。
同时感谢学院其他所有任课老师和所有同学在这四年来给自己的指导和帮助,是他们让我不断成长,并在各方面取得显著的进步,在此向他们表示我由衷的谢意。
本文参考了大量的文献资料,在此,向各学术界的前辈们致敬!
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