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所有细胞被同步化在细胞周期中某一特定时期。
有DNA合成阻断法和分裂中期阻断法两种
DNA合成阻断法:
采用低毒或无毒DNA合成抑制剂特异抑制DNA合成,而不影响其它时期的细胞进行细胞周期运转,从而将被抑制的细胞抑制在DNA合成期的实验方法,原理:
目前采用最多的DNA合成抑制剂是TdR和HU。
将抑制剂加入培养液并继续培养一段时间(TG2+TM+TG1),所有细胞被抑制在S期;
因为此时细胞可能处于S期中的任何时期,其时间区段仍然较宽,若去除抑制剂,细胞仍不能有效进行同步运转,因而采用两次DNA合成抑制剂处理,将细胞最终抑制在G1/S期交界处狭窄的时间区段。
抑制剂去除后细胞就可进行同步细胞周期运转。
步骤:
将抑制剂加入培养液S期细胞立刻被抑制,继续培养一段时间(TG2+TM+TG1)后所有细胞被抑制在G1/S期交界处;
洗脱TdR更新培养液后阻断于S期的细胞开始复制DNA并沿细胞周期运转;
再向培养液中第二次加入TdR,培养一段时间后所有细胞被抑制在G1/S期交界处;
洗脱TdR培养一段时间后可获得S期和G2期不同时间点的同步化细胞。
同步化效率高,适合于所有体外培养的细胞体系
分裂中期阻断:
某些药物如秋水仙素等可以抑制微管聚合,能有效抑制细胞分裂器形成,将细胞阻断在细胞分裂中期。
处于间期的细胞受药物影响小可继续运转到分裂期,因而在药物持续存在情况下处于分裂期的细胞数量逐渐累积,将分裂期细胞培养可得大量分裂中期细胞,它可继续分裂并进行同步运转,从而获得G1期不同阶段细胞。
操作简便效率高;
缺点;
药物毒性大,处理时间过长,所得细胞不能恢复正常细胞运转
在实际工作中常把几种方法并用以获得大量同步化细胞。
条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用,将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。
,
3.BrdU
用于测定细胞周期长短的标记物,通过标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定细胞周期各时期的时间长短,适用于细胞种类构成相对简单,细胞周期时间较短,周期运转均匀的细胞群体,BrdU不具放射性因而对细胞周期无干扰,检测被标记的细胞可用抗BrdU抗体作免疫细胞化学染色
4.膜的不对称性和流动性.
1膜的不对称性是指膜脂和膜蛋白的不对称性
膜脂的不对称性是指同一种膜脂分子在膜的脂双层中呈不均匀分布。
糖脂的分布表现出完全不对称性,其糖侧链都在质膜的ES面(质膜的细胞外表面),所以糖脂仅存在于质膜的细胞外小页。
糖脂的不对称分布是完成其生理功能的结构基础。
磷脂分子不对称分布可能与膜蛋白不对称分布有关
膜蛋白的不对称分布:
膜周边蛋白和内在蛋白在质膜上都呈不对称分布,膜蛋白的不对称分布是指每种膜蛋白分子在膜上有明确的方向性。
如细胞表面受体,膜上载体蛋白都是按一定方向传递信号和转运物质的,与细胞膜相关的酶促反应也都发生在膜的某一侧面,特别是质膜上的糖蛋白,其糖残基均分布在质膜(ES)面。
各种生物膜的特征及其生物学功能主要由膜蛋白决定。
膜蛋白的不对称性是生物膜完成时间和空间上复杂有序的各种生理功能的保证
膜的流动性是生物膜基本特征之一,也是细胞进行生命活动的必要条件
膜脂的流动性:
脂分子的侧向运动,由脂分子本身性质决定,脂肪酸链越短,不饱和程度越高,膜脂流动性越大。
温度对膜脂运动由明显影响,各种膜脂都有其不同的相变温度,在生物膜中膜脂的相变温度由组成生物膜的各种脂分子的相变温度决定,在细菌和动物细胞中常通过增加不饱和脂肪酸含量调节膜脂的相变温度以维持膜脂的流动性;
在动物细胞中胆固醇对膜的流动性也起调节作用。
胆固醇分子既有与磷脂分子结合限制其运动的作用,也有将磷脂分子隔开使其更易流动的作用。
最终效应取决于上述两种作用的综合结果,多数情况下,胆固醇的作用是防止膜脂由液相变为固相以保证膜脂处于流动状态
膜蛋白的流动性:
通过荧光抗体免疫标记实验证明了膜蛋白的流动性。
膜的流动性受多种因素影响;
细胞骨架不但影响膜蛋白的运动,也影响其周围的膜脂的流动。
膜蛋白与膜脂分子的相互作用也是影响膜流动性的重要因素
5.去垢剂
一端亲水一端疏水的两性小分子,是分离与研究膜蛋白的常用试剂,分离子型去垢剂和非离子型去垢剂。
常用的离子型去垢剂:
十二烷基磺酸钠(SDS),可使细胞膜崩解并破坏蛋白内部非共价键引起蛋白质变性;
常用的非离子型去垢剂TRITONX-100,可使膜崩解,但可保持有生物活性的膜蛋白
6.clathrin(网格蛋白)
真核细胞通过胞饮作用完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输,将物质从质膜运往胞质以及从胞内体到溶酶体的运输。
由胞饮泡介导转运,胞饮泡的形成需要网格蛋白帮助,网格蛋白由重链和轻链组成的二聚体。
当配体与膜上受体结合结合后,网格蛋白聚集在膜下一侧形成质膜内凹,称网格蛋白有被小窝,一种小分子GTP结合蛋白在小窝颈部装配称环,结合蛋白水解GTP引起颈部缢缩,最终脱离质膜形成网格蛋白有被小泡。
网格蛋白有被小泡也负责蛋白质从高尔基体TGN向质膜,胞内体或溶酶体和植物液泡运输
7.liposome
是脂质体,根据磷脂分子在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势制备的人工膜。
单层脂分子铺展在水面时,极性端插入水相非极性尾部面向空气,搅动后形成极性端向外而非极性端在内的分子团或形成双层脂分子的球形脂质体。
用来研究膜脂和膜蛋白生物学性质的材料;
脂质体中裹入DNA可用于基因转移;
裹入不同药物可用于治疗疾病;
与单抗技术结合,可使药物更有效的作用于靶细胞以减少对机体损伤
8.细胞培养细胞融合细胞拆合
细胞培养:
是将从机体取出的细胞在体外培养,扩增的技术。
包括原核细胞如细菌,真核单细胞生物如酵母菌和四膜虫;
动植物细胞和病毒细胞的培养。
动物细胞培养类型:
原代培养细胞(从机体取出后立即培养的细胞),传代培养细胞(适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞),细胞株:
传代细胞传40-50代次后仍是正常二倍体,并有接触抑制行为;
细胞系:
亚二倍体,接触抑制丧失。
植物细胞类型:
原生质体培养(体细胞培养):
经无菌培养诱导分化最终长成植株或进行体细胞杂交获得杂交植株;
单倍体细胞培养:
花药培养。
从小孢子直接发育成胚状体长成单倍体植株或通过愈伤组织诱导分化出芽和根最终长成植株。
非细胞体系的培养
细胞融合:
两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。
动物细胞融合用灭活的病毒或化学物质介导。
基因型相同的细胞融合成同核融合细胞,基因型不同的细胞融合成异核融合细胞
细胞拆合;
为了研究核质相互作用,把真核细胞的核质分离,然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合,形成核质杂交细胞的技术叫细胞拆合。
有物理法和化学法两种类型。
物理法:
用机械方法去核将其它细胞核注入去核细胞质中。
化学法:
用松胞素B使细胞产生排核现象,再用离心技术将核质分离,使核与另一胞质融合
9.Taxol.Colchicie.Philloidin(什么用?
标记的Philloidin可以染色F-action.
Taxol是紫杉酚.Colchicie是秋水仙素,它们是微管特异性结合药物
用低浓度的秋水仙素处理活细胞可立即破坏纺锤体结构,秋水仙素并不直接破坏微管而是阻断微管蛋白装配成微管。
结合有秋水仙素的微管蛋白可装配到微管末端,但组织其它微管蛋白加入
紫杉酚能促进微管的装配,并使已形成的微管稳定,但这种稳定性的增加对细胞是有害的,使细胞周期停止于有丝分裂期,所以为行使正常的微管功能,微管处于动态装配和解聚状态是重要的
Philloidin是鬼笔环肽,是微丝特异性结合药物,由毒蕈产生的双环杆肽,与微丝有强亲和作用,使肌动蛋白纤维稳定,抑制解聚,只与F肌动蛋白结合不与G肌动蛋白结合,荧光标记的鬼笔环肽可清晰显示细胞中的微丝
10.怎样知道细胞处于细胞周期中的S期?
11.PCC.
PCC是染色体超前凝集,M期细胞与其它间期细胞融合后,间期细胞发生形态各异的染色体凝集,称为PCC。
G1期PCC为细线状,S期为粉末状,G2期为双线染色体状。
说明M期细胞可以诱导PCC,M期细胞中有诱导染色体凝集的因子
11.怎样知道细胞机体内有mpf活性?
MPF即细胞促分裂因子,是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶;
由M期周期蛋白形成的复合物。
功能:
启动细胞从G2期进入M期的相关事件
将HELA细胞同步化在细胞周期不同时期,然后将M期细胞与其它间期细胞融合后,间期细胞发生形态各异的染色体凝集。
与M期细胞融合的不同间期细胞产生的PCC形态不同。
说明M期细胞可以诱导PCC,M期细胞中有诱导染色体凝集的因子即MPF
用非洲爪卵做实验用孕酮诱导卵母细胞成熟,将诱导成熟的卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞中,可以诱导后者成熟,再将后者的细胞质注射到新的卵母细胞中,后者又被诱导成熟,在将刚被诱导成熟的卵母细胞的细胞质注射到另一些新的卵母细胞中,仍可诱导卵母细胞成熟,所以再成熟的卵细胞的细胞质中有MPF可诱导卵母细胞成熟
12.从G2---M期与CDK1激酶的调控机制.
CDK1激酶即MPF或P34CDC2,由P34CDC2和周期蛋白B结合成。
P34CDC2蛋白在细胞周期中含量稳定,而周期蛋白B含量呈现周期性变化。
P34CDC2和周期蛋白B结合后才表现激酶活性。
所以CDK1激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累,周期蛋白B在G1期晚期合成,通过S期,含量不断增加,到达G2期,含量达到最大值。
随周期蛋白B含量达到一定程度,CDK1激酶活性开始出现。
到G2期晚期阶段,CDK1活性达到最大值并一直维持到M期中期阶段。
CDK1激酶通过周期蛋白某些蛋白质磷酸化,改变其下游的某些蛋白质的结构和启动其功能,实现其调控细胞周期的目的。
CDK激酶活性受多种因素综合调节,周期蛋白与CDK结合是CDK激酶活性表现的先决条件,周期蛋白与CDK1结合形成复合体后,mik1和CDK激酶催化CDK1Thr14,Tyr15,Thr161磷酸化,然后在CDC25催化下,其Thr14,Tyr15,去磷酸化,才能表现出激酶活性,CDK1激酶即MPF或p34cdc2,p34cdc2本身没有激酶活性,但当其与有关蛋白结合后,其基酶活性才能表现出来,它使多种蛋白底物磷酸化,从G-M过程中起中心调节作用。
14.比较干细胞,癌细胞.永生细胞,终末分化细胞的生长特点.(永生细胞与癌细胞是同一概念吗?
)
:
细胞全能性是指细胞经分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能或特性。
受精卵和早期胚胎细胞都是全能性细胞。
植物细胞具有全能性,在适宜的条件下可培育成正常的植株;
动物细胞核移植实验证明细胞核具有发育全能性
高等动物细胞随着胚胎发育,细胞逐渐丧失了发育成个体的能力,仅具有分化成有限细胞类型及构建组织的潜能,这种潜能称多潜能性。
具有多潜能性的细胞称干细胞
•干细胞分化模式:
胚胎干细胞:
具有分化成多种细胞类型及构建组织的潜能,如小鼠胚胎发育囊胚期的原始内层细胞
造血干细胞:
成体中具有分化成多种血细胞能力的细胞
单能干细胞:
仅具有分化成某一种类型能力的细胞
终末分化细胞:
干细胞最终形成的特化的细胞类型。
由于分化程度高,一旦生成后则终生不再分裂,如横纹肌细胞,血液多型核白细胞
在生物整个发育过程中,细胞由全能性细胞逐渐转化成多能或单能干细胞,但细胞核始终保持其分化的全能性,大多数细胞保持其完整的基因组或染色体组不变,克隆羊多莉(将羊的乳腺细胞的细胞核植入去核的卵细胞中)进一步证明了终末分化细胞的细胞核也具有全能性
癌细胞:
基因突变可能导致某些分化细胞的生长与分裂失控,脱离衰老和死亡的正常途径成为癌细胞。
癌细胞的细胞类型与特征相近,但基因组突变形式多样。
特征:
细胞生长与分裂失去控制,具有无限增殖能力,成为“永生”细胞。
具有扩散性,癌细胞的细胞间粘着性下降,具有侵润性和扩散性,这是癌细胞的基本特征。
在分化程度上癌细胞低于良性肿瘤细胞,且失去了许多原组织细胞的结构和功能。
细胞间相互作用改变(识别改变;
表达水解酶类;
产生新的表面抗原)蛋白表达谱系或蛋白活性改变(胚胎细胞蛋白、端粒酶活性升高)mRNA转录谱系的改变(少数基因表达不同;
突变位点不同,表型多变)染色体非整倍性
恶性转化细胞同癌细胞一样具有无限增殖的潜能:
在体外培养时贴壁性下降,失去接触抑制,培养时对血清依赖性降低,当将恶性转化细胞注入易感动物体内,往往会形成肿瘤
15.细胞周期主要变化.
细胞周期是指细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的一个有序过程。
其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。
细胞周期时相组成:
间期,G1,S,G2,M:
有丝分裂期,胞质分裂期。
细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转,在间期细胞体积增大(生长),在M期细胞先是核分裂,接着胞质分裂,完成一个细胞周期。
G1:
与DNA合成启动相关,开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂等,同时染色质去凝集。
G2:
DNA复制完成,在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子,
DNA复制与组蛋白合成同步,组成核小体串珠结构
S期DNA合成不同步
M期:
即细胞分裂期,真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式,即有丝分裂和减数分裂。
遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。
有丝分裂:
标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体;
第二个特征细胞骨架解聚,有丝分裂纺锤体开始装配;
Golgi体、ER等细胞器解体,形成小的膜泡;
这种染色体由两条染色单体构成;
在前期末,染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为动粒;
间期动物细胞含一个MTOC,即中心体,在S期末,两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒,形成两个中心体。
当前期开始时,2个中心体移向细胞两极,并同时组织微管生长,由两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相连,最后形成有丝分裂纺锤体。
前中期:
核膜破裂成小的膜泡,这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体纺锤体微管与染色体的动粒结合,捕捉住染色体每个已复制的染色体有两个动粒,朝相反方向,保证与两极的微管结合;
纺锤体微管捕捉住染色体后,形成三种类型的微管;
不断运动的染色体开始移向赤道板。
细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。
中期:
所有染色体排列到赤道板上,标志着细胞分裂已进入中期,着丝粒微管动态平衡形成的张力确保染色体正确排列在赤道板上,排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动
后期:
大致可以划分为连续的两个阶段,即后期A和后期B
后期A,动粒微管去装配变短,染色体产生两极运动
后期B,极间微管长度增加,两极之间的距离逐渐拉长,介导染色体向极运动
末期:
染色单体到达两极,即进入了末期,到达两极的染色单体开始去浓缩,核膜开始重新组装,Golgi体和ER重新形成并生长,核仁也开始重新组装,RNA合成功能逐渐恢复有丝分裂结束
胞质分裂开始于细胞分裂后期,在赤道板周围细胞表面下陷,形成环形缢缩,称为分裂沟。
分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓度升高的变化有关。
胞质分裂开始时,大量肌动蛋白和肌球蛋白在中心体处组装成微丝并相互组成微丝束,环绕细胞,称为收缩环。
收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。
与动物细胞胞质分裂不同的是,植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和细
胞壁而将细胞分开
减数分裂:
细胞仅进行一次DNA复制,随后进行两次分裂,染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂
意义:
确保世代间遗传的稳定性;
增加变异机会,确保生物的多样性,增强生物适应环境变化的能力。
减数分裂是生物有性生殖的基础,
是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。
过程:
遗传物质只复制一次,细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半,S期持续时间较长,同源染色体在减数分裂期I配对联会、基因重组,减数分裂同源染色体配对排列在中期板上,第一次分列时,同源染色体分开。
前期I分为细线期,偶线期,粗线期,双线期,终变期等五个阶段。
形成联会复合体,同源染色体间遗传物质重组,产生新的基因组合
16.细胞周期的主要检验点,各起什么作用.
细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制,主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系。
主要有G1期检查点,S期检查点,G2期检查点,纺锤体装配检查点
G1期检查点:
在G1期晚期有一特定时期,如果细胞继续走向分裂则可以通过这个时期进入S期,开始合成DNA并继续前进,直到完成细胞分裂。
在芽殖酵母中,这个特定时期称为起始点,起始点过后细胞开始出芽,DNA开始复制。
在其它真核细胞中称为限制点或检查点。
起始点是G1晚期的一个基本事件,细胞只有在内外因素共同作用下才能完成这一基本事件。
G2期检查点:
细胞能否进入M期受G2期检查点控制,检查DNA是否完成复制,细胞是否已生长到合适大小,环境因素是否利于细胞分裂等
17.P53
P53是肿瘤抑制基因,其产物主要存在于细胞核内,是人肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。
正常细胞凋亡并不要求其参与,在依赖于P53蛋白的细胞凋亡中,P53基因通过调节BCL2和BAX基因的表达影响细胞凋亡的
18.细胞凋亡的分子机制
线虫凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡,ced9基因阻止ced3/ced4的激活,抑制细胞凋亡。
Ced3哺乳类同源物是ICE,即Caspase1,Caspase家族与凋亡:
Caspase活性位点是半胱氨酸,裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键,因此称为Caspase,Caspase活化,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,Caspase自身以非活化的Procaspase存在,其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化
•凋亡信号通路:
当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后,凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合,这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位,Procaspase相互活化并产生级联反应,使细胞凋亡。
下游Caspases活化后,作用底物:
裂解核纤层蛋白,导致细胞核形成凋亡小体;
裂解DNase结合蛋白,使DNase释放,降解DNA形成DNALadder;
裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白,使凋亡细胞皱缩、脱落,便于细胞吞噬;
导致膜脂PS重排,便于吞噬细胞识别并吞噬。
Bcl-2是一种原癌基因,是ced-9在哺乳类中的同源物,能抑制细胞凋亡;
与线粒体及内质网膜相结合;
Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域;
Bcl-2家族成员的基因中,常常含有三个保守的Bcl-2同源区,即BH1,BH2和BH3
线粒体与细胞凋亡:
当Caspase8活化后,它一方面作用于Procaspase3,另一方面使Bid裂解成2个片段,其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体,与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物,导致细胞色素C释放。
CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子结合并活化Apaf-1,活化的Apaf-1再活化Procaspase9,最后引起细胞凋亡
19.细胞凋亡与细胞坏死.
细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,所以也常常被称为细胞编程死亡。
凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。
生物学意义:
细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行,自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。
二者的主要区别是,细胞凋亡过程中,细胞质膜反折,包裹断裂的染色质片段或细胞器,然后逐渐分离,形成众多的凋亡小体,凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。
整个过程中,细胞质膜的整合性保持良好,死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去,因而不引发炎症反应。
相反,在细胞坏死时,细胞质膜发生渗漏,细胞内容物,包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段,释放到胞外,导致炎症反应
20.差别基因转录.
是一种重要的调控机制,在特定时间真核细胞通过差别基因转录选择性合成蛋白质。
在胚胎发育的不同阶段,不同组织及暴露在不同刺激下的细胞其表达基因均不相同。
转录调控由很多蛋白质即转录因子的作用主导
21.癌细胞
癌细胞的细胞类型与特征相近,但基因组突变形式多样
22.细胞决定
一个细胞接受了某种指令,在发育中这一细胞及其子代细胞将区别于其它细胞而分化成某种特定的细胞类型,即在形态结构功能等分化特征尚未出现前就已确定了细胞的分化命运
23.全能性
24.试述转分化的过程及其意义
一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞的现象称转分化。
转分化要经历去分化和再分化的过程。
去分化是指分化细胞失去其特有的结构与功能变成具有未分化细胞特征的过程。
如植物体细胞形成未分化细胞群-愈伤组织为去分化现
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