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生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。

科学出版社，2010

参考资料：

1..袁道强主编：

生物化学实验（第1版）。

　化学工业出版社，2011　

五、实验项目数据表

序号

实验名称

学时

类别

要求

类型

设备套数

每组人数

每组常规仪器设备名称，数量

每组主要消耗材料名称、数量、消耗额

1

蛋白质的沉淀反应

3

2

10人

水浴锅1台

试管2支、滤纸3张

影响酶活性的因素

试管5支

血清醋酸纤维素薄膜电泳

6

25人

电泳仪1台电泳槽1台

薄膜条1张干

4

血清胆固醇的测定

分光光度计1台

试管3支

5

转氨基作用

烘干箱1台层析缸1个

层析滤纸1张

血清尿素氮的测定

试管2支、移液管4支

7

动物组织基因组DNA的提取

EP管6支、移液枪3支

8

实验基本操作考核

试管1支、移液枪1支、移液管1支

[注]1）类别：

2：

指为技术（或专业基础）课开设的教学实验项目。

2）要求：

0：

必修1选修

3）类型：

演示1：

验证2：

综合3：

设计

4）每组人数：

指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。

六、各实验项目教学大纲

实验一蛋白质的沉淀反应

【预习要求】

预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。

【实验目的】

1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；

2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

【实验内容】

（一）蛋白质的盐折

1.原理

大量中性盐类如硫酸铵（（NH4）2SO4）、硫酸钠（Na2SO4）和氯化钠（NaCl）等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。

各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。

例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。

当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。

盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。

因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。

2.操作步骤

①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。

②另取1小试管置于试管架上，插入准备好的滤纸和漏斗。

将操作“1”之混合液倾入漏斗内过滤。

观察结果。

③向操作“2”的滤液中逐步加入米粒大小固体（NH4）2SO4,边加边摇匀，直至饱和为止。

再向管内加入少量蒸馏水，观察结果有何变化。

④将操作“2”的滤液漏斗置于1支小试管上，用玻棒戳穿滤纸尖部，加少量蒸馏水将滤纸上的沉淀粉洗入试管内，摇匀后观察和解释结果。

（二）重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质

1.原理

重金属粒子如Pb2+、Cu2＋、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。

三氯乙酸属于生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。

它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。

①编号2支小试管，各加5％鸡蛋清溶液20滴。

②向试管1加入0.1mol/LNaoH溶液1滴，混匀。

加入3％CuSO4溶液4滴，混匀。

③向试管2加入5％三氯乙酸溶液10滴，混匀。

④记录结果。

（三）乙醇沉淀蛋白质

1.原理

某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等，能破坏蛋白质的水化膜，降低其在溶液中的稳定性。

当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时，蛋白质胶粒上的电荷被中和。

加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。

反应在0—4℃下进行，并应立即分离沉淀物，否则蛋白质会变性。

2.操作步骤

a） 

编号2支小试管，各加5％鸡蛋清溶液10滴。

b） 

每管内均加入95％乙醇20滴，边加边混匀，静置片刻后观察结果。

c） 

向试管1内加入饱和NaCl溶液1—2滴，观察结果。

（四）、加热沉淀蛋白质

1、原理：

几乎所有的蛋白质都可因加热而凝固，这是由于温度升高，则容易出现沉淀。

在酸性、碱性条件下，蛋白质则易变性，此时若温度升高，虽变性并不出现沉淀，在冷却后加酸或加碱调节PH值达蛋白质的等电点时，则有沉淀析出。

2、操作：

1）取试管4支，编号，按下表操作

管号

试剂（滴）1234

5%蛋白质溶液20202020

1%醋酸＿1＿＿

10%醋酸＿＿10＿

10%NaOH＿＿＿10

2）将上述试管同时放入沸水浴中加热，观察并记录各试管出现的现象，解释变化原因。

3）取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴入10%氢氧化钠溶液并观察现象。

4）向第4管中慢慢滴入10%的醋酸溶液并观察现象。

【教学方法】

1.课堂讲授

2.指导学生操作

3.课堂提问

4.课外实验报告作业

【复习思考题】

1.什么因素可导致蛋白质的沉淀作用？

举例说明。

2.蛋白质的沉淀有几种？

试举例说明。

3.蛋白质的沉淀与变性之间有何关系？

蛋白质在发生沉淀和变性后，其性质发生哪些变化？

实验二影响酶活性的因素

预习各小实验的具体实验原理和操作内容

验证酶的特异性，观察影响酶促反应的一些因素，加深对酶性质的认识。

1）、实验原理

淀粉酶能催化淀粉水解，生成的麦芽糖属于还原性糖，能使班氏试剂中二价铜离子还原成一价亚铜，生成砖红色的氧化亚铜。

淀粉酶不能催化蔗糖水解，所以不能产生具有还原性的葡萄糖和果糖，蔗糖本身又无还原性，故不与班氏试剂产生颜色反应。

唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解，生成大小不同的糊精及最后水解成麦芽糖。

淀粉及糊精遇碘各呈不同的颜色反应。

直链淀粉遇碘呈蓝色，糊精按分子的大小遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色。

最小的糊精和麦芽糖遇碘不显色。

根据颜色反应，可以了解淀粉水解的程度。

由于在不同的温度、不同的酸碱度下唾液淀粉酶活性高低不同，所以淀粉水解的程度也不同。

因此，通过与碘产生的颜色反应判断淀粉水解的程度，来了解温度、pH、和激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。

2）、实验操作

1、稀释唾液的配制

将痰吐尽，用水漱口，再含蒸馏水做咀嚼运动，2分钟后吐入烧杯中，再用滤纸过滤后待用。

2、酶的特异性实验

取2支试管标号后按下表加入试剂。

试剂

管号

缓冲液

（pH6.8）

淀粉溶液

（1%）

蔗糖溶液

稀释唾液

20滴

10滴

-

5滴

各管混匀后，放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，放入沸水中煮沸，观察结果。

3、温度对酶促反应的影响

（1）取三支试管，编号，每管加入pH6.8缓冲液20滴。

1%淀粉溶液10滴。

（2）将第一支试管放入37℃恒温水浴，第二支试管放入沸水浴，第三支试管放入冰浴。

（3）放置5分钟后，分别向各试管中加入稀释唾液5滴，再放回原处。

（4）10分钟后，分别向各试管中加入碘液1滴，观察三支试管中颜色的区别，说明温度对酶促反应的影响。

4、pH对酶促反应的影响

（1）取3支试管,编号后按下表加入各种试剂。

剂

试

pH5.0

pH6.8

pH8.0

1%

（2）将上面三支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。

（3）取出试管，分别加入1滴碘液，观察三支试管颜色的区别，说明pH对酶促反应的影响。

5、激活剂和抑制剂的影响

1%淀粉溶液（滴）

1%NaCl

（滴）

1%硫酸铜（滴）

1%硫酸钠

蒸馏水

稀释唾液（滴）

20

取4支试管，编号，按照下表加入试剂。

将上面4支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。

取出分别滴加碘液2～3滴，摇匀，观察现象，说明原因。

1.课堂讲授

2.指导学生操作

3.课堂提问

4.课外实验报告作业

1、影响酶活性的因素有哪些，举例说明。

2、酶的特异性分了几大类，我们实验当中验证的是哪一类？

3、何为激活剂？

何为抑制剂？

实验三血清醋酸纤维素薄膜电泳

预习实验原理和各步操作

1、掌握血清蛋白质电泳的基本原理和基本操作过程。

2、熟悉血清蛋白质醋纤维素薄膜电泳图谱的含义及临床意义。

一、实验原理

带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。

电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。

带电颗粒（球形分子）在电场中的电泳速度（V），从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度（V）与颗粒带电荷量（Q）以及电场强度（E）成正比，与球形分子的大小（半径为r）及所在介质的粘度（η）成反比。

因此,在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。

在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（moverate,M）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；

反之越慢。

但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。

二、实验操作

1、点样将醋酸纤维薄膜（2.5cm×

8cm）一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端2.0cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸（或纱布）贴紧，加盖，平衡2～3min，然后通电。

2、通电一般电压用110～140V，电流约0.4～0.6mA／cm，时间45～60min。

3、染色关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染2～3min，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。

4、定量取试管6支，编号依次为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，将电泳图谱亦按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。

再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约α1带的空白带放入空白管中。

各管中加0.4mol/LNaOH4ml，振摇数次，使染料色泽浸出，30min后，在620nm波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。

5、计算吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：

T=A+α1+α2+β+γ。

分别按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：

清蛋白（%）＝（A/T）×

100%α1球蛋白（%）＝（α1/T）×

100%α2球蛋白（%）＝（α2/T）×

100%β球蛋白（%）＝（β/T）×

100%γ球蛋白（%）＝（γ/T）×

100%现在许多实验室采用光密度计定量法。

待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约5～10min，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜。

然后在光密度计上测定吸光密度，并可绘制成曲线，或者直接计算出各种蛋白质的百分含量。

3）、临床意义血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。

如肾病综合症患者，血浆蛋白中小分子量的白蛋白漏出随尿液排出体外，导致醋酸纤维素薄膜电泳图谱中白蛋白区带明显变小变浅。

又如，慢性肝炎和肝硬化患者，由于肝细胞受损，肝脏合成血浆蛋白质的能力大大下降，使血浆白蛋白显著降低，γ球蛋白相对显著增加。

多发性骨髓瘤患者血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳图谱中可见不正常的球蛋白条带。

4）、注意事项1.电泳时，电压应控制在110～140V，不能过高，若电压太高，产热量大，则蛋白质标本会破坏，并且电压高则带电颗粒移动速度快，分离效果不理想。

2.醋酸纤维素薄膜在电泳前，一定要在缓冲液中浸透，否则有碍电泳分离，最好是浸泡过夜，效果最佳。

3、点样时样品一定要点在无光泽面，否则很难吸入，点样量不宜过多（血清样品最适宜3μl）。

其原因是醋酸纤维素薄膜承受蛋白质有限。

量过多则分子量相近的物质相互争夺迁移而重叠，影响结果观察。

4、电泳开始后，不能再取放薄膜，以防触电。

如必需进行，要先关闭电源。

1、电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？

各谱带为何种成份？

请分析原因。

2、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极，为什么？

3、电泳已开始，发现有错（膜条放置错误，滤纸未浸入缓冲液或电泳槽与电泳仪连线有错）怎样纠正（操作）？

4、肝硬化和肾衰病人的醋酸纤维素薄膜电泳图谱和区带定量测定结果有何异常，为什么？

实验四血清胆固醇的测定

预习实验原理和具体操作内容。

掌握血清总胆固醇测定原理、方法及其临床意义。

一、实验原理

用无水乙醇提取血清中胆固醇同时沉淀蛋白质，向提取液中加入硫磷铁显色剂，胆固醇与浓硫酸及三价铁作用，生成比较稳定的紫红色化合物，与同样处理的标准液进行比色，求得其含量。

二、实验操作

1.无蛋白提取液的制备

准确吸取血清0.20ml，置入干燥的小试管中，对准血清吹入无水乙醇4.8ml，使蛋白质分散成细小的沉淀，用力振荡约10s，放置5min，再次摇匀沉淀，置2000r／min离心约10min。

2．显色

取干燥试管三支，分别标记，按下表操作：

试剂（ml）\管号

空白管

标准管

测定管

抽提上清液

---

2.0

胆固醇标准应用液

无水乙醇

3.0

1．0

显色剂（沿管壁慢慢加入）

3.测定

显色剂加毕，立即振摇15～20次，置室温下冷却15min，然后用550nm波长以空白调零点，测出各管吸光度。

[计算]

测定管吸光度

×

4×

25＝血清总胆固醇mg/dl（mg/100ml）

标准管吸光度

血清总胆固醇（mg／d1）×

0.02586（或除以38.67）＝mmol／L

[正常值]

2.9～6.Ommol／L（110～230mg／d1）

（1）离心后上清液必须清亮透明，为什么不能混有细微沉淀颗粒，如果有为什么要重新离心。

（2）加入显色剂为什么必须与乙醇分成两层，然后再混合，为什么不能边加边摇？

实验五转氨基作用

预习实验原理，理解什么是纸层析。

1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

一、实验原理：

转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。

转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。

氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。

各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：

α—酮戊二酸+丙氨酸

谷氨酸+丙酮酸

本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。

纸层析属于分配层析。

以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。

有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。

由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：

物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。

1．肌匀浆的制备（由同学们自己制备）

取小白鼠一只，猛击头部处死后，立即剪颈放血，剖腹取出肝脏，用0.9%NaCl溶液洗去血液并用滤纸吸干，称取肝脏约1.0g置电动匀浆器中，再加0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液5.0ml磨成匀浆。

2.转氨基反应：

取小试管2支编号，所加试剂以滴为单位。

编 

号

试 

剂

1

2

肌匀浆

10

将2号管置沸水浴中5分钟，然后取出冷却

1%谷氨酸钾

1%丙酮酸钠

混匀后同置40℃水浴中保温45分钟（或60分钟）。

在保温过程中，时加振摇。

取出两管各加入2%醋酸2滴，再同置沸水浴中5分钟，使蛋白质完全凝固，冷却后，离心（200r/min）5分钟，（或静置10分钟），将上清液作氨基酸的纸层析。

3、层析操作

1）向层析缸中装入饱和水的酚（其深度约1.5cm）。

2）取宽4.5cm，长18cm滤纸一条，（手指不可接触纸面）在滤纸条一端2cm处划一水平线（原线），在此线上以间隔相等的距离用铅笔画四个直径约2—4mm的小圆圈，标明号码。

3）用毛细管向各小圈中央点上各种不同的氨基酸溶液，并记录之。

例如：

第一点为谷氨酸，第二点为丙氨酸，第三点及第四点为转氨基作用实验中的1号及2号试管溶液。

点样直径以3mm为宜。

4）待干燥后可重复点样一、二、三次（3-5滴，前一滴干燥后才可点后一滴），再干燥。

然后将此纸条插入上述准备好的层析缸中。

先将纸条悬挂于玻璃缸内的横玻棒上（或用棉线代替），调节其高度，使纸条的下端浸入酚内约1cm（勿使氨基酸小点与溶剂直接接触），然后把盖盖紧。

（如图20所示）。

图20上行法纸层析

5）经1～1.5小时，当溶剂上升至约10—15cm高时，取出滤纸，置烘箱烘干或用电吹风吹干，使酚蒸发。

6）将已烘干的滤纸浸入茚三酮酒精溶液（喷入茚三酮乙醇溶液，量要适中，不要过多，也不能太少。

），再置80度干燥箱中烘干（或用电吹风吹干），这时在纸的不同位置上，可见紫红色的斑点出现，用铅笔描绘溶剂前沿和斑点的中心位置。

1、在实验过程中，为什么不能用手直接触膜层析滤纸？

2、为什么谷氨酸和丙氨酸在层析滤纸上会处在不同的位置？

3、RF值是什么，跟哪些因素有关系？

实验六血清尿素氮的测定

1、了解血清尿素氮在生理代谢上的重要意义。

2、掌握测定血清尿素氮的方法和原理。

1）、实验原理：

尿素在强酸、加热条件下，与二乙酰一肟缩合成红色二嗪化合物，其颜色深浅与尿素含量成正比，与同样处理的标准液在540钠米处比色，求得尿素含量。

2）、实验操作：

1、取试管3支，按下表操作：

试剂（ml）测定管标准管

尿素氮标准应用-0.1

1：

5稀释血清0.1-

尿素氮试剂5.05.0

2%二乙酰一肟液0.50.5

2、混匀,置沸水浴中煮沸10分钟后用冷水冷却5分钟,在波长540nm处比色测定,以空白管调零.

计算：

血清尿素氮含量=测定管吸光度/标准管吸光度*0.7*5（mmol/l）

正常值：

3.2-7.1mmol/l

Ａ、注意操作误差；

Ｂ、此份血清本来是否正常？

　Ｃ、时间是否充足？

实验七动物组织细胞基因组DNA的提取

1、掌握动物组织细胞基因组DNA提取的原理和操作方法。

2、掌握相对分子质量较大的DNA纯度检测技术。

【实验内