实验 动物细胞培养基础实验技术Word文档下载推荐.docx

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主要包括物理法和化学法。

物理法：

热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。

化学法：

应用化学制品进行消毒灭菌。

（四）无菌室和操作野消毒

无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1-2次。

实验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外灯，同时启动超净台风机，40min后消毒完毕，关闭紫外线灯。

这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。

或无菌室：

每周用75%酒精擦洗后紫外灭菌。

实验培养基的配制及细胞培养的条件

一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件

1温度条件（37＋0.5）

2pH条件（7.2-7.4）

3气体条件

4水的质量（三蒸）

5渗透压

6营养条件

7无菌条件℃

二、 

培养基的分类

1平衡盐液

2天然培养基（小牛血清、胚胎液）

3合成培养基（化学成分清楚）

三、 

RPMI1640培养基的配制

1、RPMI164010g

2、丙酮酸钠0.11g

3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸）5.925g

4、NaHCO32g

5、三蒸水1000mL

四、 

过滤出菌

仪器：

不锈钢正压滤器

材料：

纤维素微孔虑膜（0.22mm孔径）

装好后消毒

五、 

完全培养基的配制

RPMI1640培养液85mL

小牛血清10mL

谷氨酰氨1mL

抗菌素（青、链霉素）1万单位1mL

实验动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）

一、实验目的：

1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞；

2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。

二、实验原理：

小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。

因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。

三、实验材料：

SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）

CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。

四、实验步骤：

1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5×

104/毫升，置37℃5%CO2培养箱中培养。

2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。

3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。

4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。

要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。

5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用8—10%小牛血清的培养基，这样细胞的繁殖速度亦慢，一般可间隔3天更换一次培养液。

6、本试验要求各组将细胞自小瓶转入中瓶再转入较大的培养瓶中生长，并用对数增长期的细胞用于冻存和复苏实验（见实验六）。

五、结果观察：

1、细胞传代前后的生长状态及速度的观察；

2、细胞转瓶后生长情况观察；

3、了解生长良好，一般及较差细胞的显微镜下观察；

4、传代细胞培养的体会。

六、注意事项：

1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作；

2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿；

3、传代转瓶时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个人实践经验而决定；

4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉强为之。

实验淋巴细胞杂交瘤的制备

一、实验目的

1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程；

2、学会观察与判别融合细胞的出现，并计算融合率。

小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。

经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。

如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。

这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。

免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤细胞株，CO2培养箱

超净工作台倒置显微镜光学显微镜恒温水箱

计数板、计数器、盖玻片；

离心机手提式自封消毒锅弯头滴管

吸量管（1.0、0、5.0毫升）注射器（5毫升，10毫升）针头（7#）

细胞培养瓶24孔、96孔培养板（天津产或进口）酒精灯

120目钢丝网

￠9cm平皿

50ml带盖塑料离心管

100毫升三角瓶、青毒素小瓶

烧杯（100，500，1000毫升）

微滤器1000毫升正压不锈钢滤器

微孔滤膜

眼科剪、镊

脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸

HAT培养基

HT培养基

无血清培养基

15%小牛血清培养基

小牛血清

乙醇（AR，工业纯）

C—PBS

四、培养基与试剂的配制：

1、RPMI-1640培养基的配制；

RPMI-1640粉10.4g

丙酮酸钠0.11g

Hepes5.925g

三蒸水1000ml

磁力搅拦器搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4℃中保存。

2、200mML-谷氨酰胺的配制：

L-谷氨酰胺1.461g

三蒸水100ml

深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20℃保存。

4.5%碳酸氢钠（NaHCO3）配制

NaHCO35g

三蒸水100ml

8磅高压灭菌15分钟，在4℃保存。

如分装小瓶，每瓶4.2ml。

5、次黄嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：

次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）68.05mg

胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T）19.4mg

三蒸水50ml

在45—50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管1—5ml，在-20℃保存。

6、氨基碟呤（A）1.76mg

三蒸水90ml

IN氢氧化钠0.5ml

溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至100ml

过滤除菌，分装小试管内，每管1—5ml，在-20℃保存。

7、无血清RPMI-1640100ml

L-谷氨酰胺200nM（0.2）1.0ml

抗菌素（青、链霉素各1万单位）1.0ml

5%碳酸氢钠4.2ml

8、RPMI-1640完全培养基配制

RPMI-1640完全培养液100ml

L-谷氨酰胺200mM（0.2m）1.0ml

青、链霉素（各1万单位/ml）1.0ml

5%碳酸钠4.2ml

小牛血清（灭活）15ml

9、HAT培养基的配制：

RPMI-1640完全培养基100ml

100倍HT母液1.0ml

100倍A母液0.8ml

10、HT培养基的配制

100倍HT母液1.0ml

11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制

PEG10.0g

8磅15分钟，或煮沸20分钟灭菌并且融化，冷至50℃时加入。

RPMI-1640无血清培养基10ml

混合均匀，分装小试管内，每管0.7ml，在-4℃中保存。

12、0.15MPH7.2枸橼酸钠-PBS配制：

NaCI6.4gKCI0.16gNaHPO4·

H2O2.32gKH2PO40.16g

枸橼酸钠7.6g二蒸水1000ml

分装在100ml瓶中，每瓶50—100ml，8磅15分钟高压灭菌后，在4℃保存。

13、20%二甲基亚矾（DMSO）细胞保存液的配制（按体积计算）：

小胎牛血清5份

RPMI完全培养基3份

二甲基亚矾（DMAO）2份

混匀，在4℃保存，不必过滤除菌或高压清毒二甲亚矾，因它也是有毒的以至于自身是无菌的。

14、8-氮鸟嘌呤100倍母液的配制

8-氮鸟嘌呤1152mg

0.36%NaHCO21.0ml

4NNaOH100ml

三蒸水100ml

过滤除菌，分装小瓶，每瓶1.0ml，在-40℃保存。

15、0.1%伊文氏兰液配制：

伊文氏兰液（Fveng’sblue）0.1g

0.15MPH7.2枸楷酸钠-PBS100ml

混匀，4℃保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀释成0.1%。

五、实验步骤：

1、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×

107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；

2、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；

3、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；

4、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。

注意尽可能不搅动细胞；

5、再经100转/分离心10分钟。

弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；

6、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。

CO2含量为5%；

7、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。

2周后使用HT培养基。

1、细胞杂交瘤的实验全过程必须是在严格的无菌条件下进行，任何一个环节的疏忽均可导致严重污染。

因而须严格的无菌操作。

2、试剂价格相对昂贵，应注意节省。

3、试验中的各个环节，尤其是结细胞融合过程和细胞克隆的筛选工作更为重视。

实验细胞克隆化培养技术—有限稀释法

1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；

2、学会细胞克隆形成的辩观察技能；

3、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。

克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。

一般杂交瘤细胞需经过52—3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率。

该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。

是细胞株的常用方法。

杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管，00橡胶塞，饲养细胞（3-6×

105/ml、见腹腔细胞的制备）。

1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）；

2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液。

3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右。

4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞。

5、每孔0.1毫升细胞悬液。

6、置37℃5%CO2培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果。

7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。

并重复检测1-2次。

8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。

五、实验结果：

实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。

1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理；

2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低；

3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板；

4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清；

5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。

七、说明：

哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成细胞克隆。

运用这项技术可以制作细胞成活曲线，即在接种相同数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线，观察其对细胞的听见害程度。

由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞。

实验杂交瘤细胞的冷冻保存和复苏技术

一、目的：

掌握冻存和复苏细胞的技术

杂交瘤细胞株一经建立应尽快冻存，以保证杂交瘤细胞不至于因传代污染或因变异而丢失，在克隆化前将抗体阳性的样本冻存，在一旦克隆传代失败或在增殖过程中丢失，还可将保存的杂交瘤细胞重新复苏，继续进行实验。

将细胞冻存还可避免繁重的细胞传代工作量以及不明原因的污染和细胞在培养过程中的变异。

用于细胞融合的骨髓细胞株也可同样方法保存：

以取得稳定可靠的亲本细胞来源。

因此，冷冻保存细胞株是杂交瘤研究的一项重要的实验技术。

该技术同样适用于一般动物细胞的冷冻和保存。

二、原理：

主要是城保护下，降低保存温度甚至用深低温（—196）保存，借以减低或几乎停止细胞的活力的能量产生机构，从而延长保存期。

冷冻保护剂有许多种类，而较普遍采用的是二甲基亚矾（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低细胞的新陈代谢，又能维护细胞膜的强度，使水分不易进入细胞而影响其冷冻保存。

三、试剂、器材：

1640完全培养基，10%DMSO-1640完全培养基，无血清1640培养基。

恒温水浴、液氮罐、玻璃安瓶或带密封盖的塑料小管，装安瓶的小布袋，刻度离心管，胶塞、培养或小培养瓶、小烧杯、细胞计数用器材。

四、操作方法：

1、细胞悬液配制：

取生长旺盛、形态良好的待冻存细胞，用离心法收集细胞，并用冻存培养基将细胞调至3-5×

106/ml。

2、分装：

将细胞悬液注入2ml安瓶中或塑冷冻管中，每支0.5—1.0ml，封紧（安瓶用火焰封口），每只安瓶上标上细胞名称、冻存日期、装入小布袋中。

3、缓慢降温，原则上要使冻存细胞瓶的温度每分钟下降1℃，待降至-60℃-70℃时，再将细胞浸没有液氮中，各实验室的操作方法根据细胞的种类和经验略有不同，以下两法均可使用。

①将细胞管先放置4℃或普通冰箱冰格内2小时，再移至液氮容器面上，停留30分钟后（约-60℃-70℃），再浸入液氮中。

②将细胞瓶放入壁厚1—2cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在—80℃冰箱中过夜，次日将细胞瓶移至液氮中。

亦有人将安瓶放在4℃冰箱中4小时，再置安瓶于气态氮中20分钟，然后立即放入液态氮中。

五、细胞复苏：

1、从液氮罐中取出安瓶或其它类型塑料冷冻管，有时冷冻管因未封严，浸入液氮后，取出后安瓶或管子内液迅速气化可以爆炸（力量有限）因此应戴手套和防护眼镜。

2、迅速放入装有37℃-40℃的热水烧杯中（放在超净工作台内），用镊子夹紧并不时摇动，令尽快融化。

3、如用安瓶冷存，取出后，用70℃酒精擦试消毒后。

折断颈部，如用塑料管，则防止融融时渗入水，打开盖子，用吸管吸出悬液，注入离心管中，再补加10毫升培养液（滴加）；

或直接滴入装有10ml培养液中（可以用无血清培养液）。

4、低速离心（1000转/分）5-7分钟，去上清，一般不再重复用培养液洗一次。

5、用培养液适当稀释后，装入培养瓶中或24孔培养板中37℃5%CO2培养箱内培养，次日更换一次培养液后，继续培养。

6、以后仍按常规传代培养进行培养。

注意事项：

1、安瓶或管内冻存的细胞数量要充分，在融解后能允许做1：

10-1：

20的稀释，最后细胞数量/毫升仍要比一般高一些，一般再培养接种浓度为5×

104/毫升，因此冻存细胞密度应达到107毫升，在融后稀释20倍后，仍能保持5×

105/毫升数量。

2、加入一定量的饲养细胞有助于复苏细胞成活，饲养细胞的密度一般105/毫升左右。

3、一般复苏细胞的成活率在20—70%左右。

实验百合鳞茎培养

一、目的要求

百合在生产上存在着三个亟待解决的问题：

一是用种量很大，每667m2百合按常规栽培，需用种250kg左右；

二是繁殖系数低，每667m2只能收获1000kg左右；

三是难以进行有性繁殖。

因而采用组织培养方法对百合进行快速无性繁殖很有前途。

本实验的目的是学习和掌握百合鳞茎培养的基本方法和技术。

二、材料、仪器与试剂

1．材料：

百合。

2．仪器：

超净工作台（或无菌箱）、灭菌锅、显微镜、解剖刀、长把镊子、烧杯（500m1）、9cm培养皿、移液管等。

3．试剂：

①MS培养基，并附加NAA（或2，4-D及IBA）0．5～1．0mg／L和BA（或KT）0．1～1．Omg／L；

②75％酒精；

③O．1％升汞。

三、方法步骤

1．外植体消毒。

取健康的百合鳞片，先用洗涤剂清洗干净，再用75％酒精消毒30s和0．1％升汞消毒30min左右，最好加一点吐温以得到良好的消毒效果，再用无菌水冲洗3次。

较大鳞片可切成小切块以备接种。

2．外植体的接种和培养。

将消毒后的鳞片小切块，在无菌条件下直接接种于固体培养基中培养。

培养室温度一般为25℃±

1℃，每天用日光灯照射lOh左右。

光照度为1000～15001x。

3．培养基的选用。

培养基一般以MS培养基为主，只要附加适当的植物生长物质即可。

生长素一般用NAA（或2，4-D及IBA）0．5～1．0mg／L。

细胞分裂素一般用BA（或KT）0．1～1．0mg／L。

为了促进根系和增加鳞茎重量，可考虑光暗交替培养和适当增加生长素的浓度。

4．试管苗的诱导。

（1）由鳞片小切块诱导成苗。

鳞片小切块接种后，一般先分化出黄绿色或绿色的球形突起的小芽点，继而芽点逐渐增大长成小鳞茎，并可生长出叶片，形成苗丛，生根后即可以从试管（或三角瓶）中取出，移栽于营养钵或大田。

也可将小鳞茎继代培养扩大繁殖。

（2）由叶片诱导成苗。

用鳞片小切块诱导分化出的苗丛，在超净台上取其无菌叶片，接种于培养基中，培养半个月后即可分化出带根的小鳞茎。

培养两个月后，每个单叶片形成的小鳞茎一般又可分化出带有根系的丛生小鳞茎4～6个。

叶片培养可直接插入培养基中，但要注意极性，不可倒置。

叶片也可平放于培养基中培养。

（3）由无菌小鳞片诱导成苗。

利用试管中的无菌小鳞茎，在超净台上将小鳞片逐片接种于培养基中（鳞片基部向下或内侧面向上）。

培养半个月左右即可开始分化，培养一个月左右即可分化出小鳞茎和根系，培养两个月后，每个小鳞片一般又可分化出带有根系的丛生小鳞茎4～6个。

（4）由愈伤组织诱导成苗。

上述外植体在分化成苗的过程中，常常也可伴随着增殖具有颗粒状似胚性细胞团的愈伤组织。

该愈伤组织在连续不断的继代培养中，一方面继续不断地增殖相似的愈伤组织，另一方面又不断地分化成苗。

一般每个试管里的愈伤组织可分化成苗20～40个。

这样即可周而复始地分化出大量的试管苗。

四、实训报告

写出该实训的报告。

实验大蒜叶片培养

一、目的要求

目前大蒜生产上存在的主要问题是病毒造成的品种退化，使产量降低。

为了克服病毒的侵染，采用茎尖培养进行脱毒和快繁。

本实验的目的是学习和掌握大蒜叶片培养的基本方法和技术，为大蒜茎尖培养奠定基础。

1．材料食用大蒜。

2．仪器超净工作台（或无菌箱）、灭菌锅、显微镜、解剖刀、长把镊子、烧杯（500m1）、9cm培养皿、移液管等。

3．试剂①MSl培养基：

MS+500mg／L水解乳蛋白、1000mg／L酵母提取物、2mg／L2，4-D；

②MS2培养基：

MS+6-BA2mg／L+NAA0．01mg／L；

③MsS3培养基：

MS+6-BA2mg／L+IAA0．05mg／L；

④MS4培养基：

MS+KT0．5mg／L+6-BA0．05mg／L十IAA5mg／L+酵母提取物800mg／L。

1．以食用大蒜的未经萌动的肉质、瓣状小鳞茎为材料，在无菌条件下去掉保护叶，用刀片将贮藏叶切成长、宽和深度各约为3mm的小块。

然后接种于MSl培养基上，诱导愈伤组织。

2．培养3d后，就有少数外植体开始膨大，10d有愈伤组织出现。

其后，在愈伤组织表面产生大量光滑的小球体。

3．将愈伤组织转移到去掉2，4-D的分化培养基上，经一个月左右可分化出苗，其中以MS2及MsS3培养基配方最好，苗的分化频率可达80％以上。

在生