单元2消毒灭菌技术Word下载.docx
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微生物学,中国医药科技出版社,1999。
【3】李榆梅主编:
药学微生物实用技术,中国医药科技出版社,2008。
作业
目标测试题
课后体会
学生对灭菌设备很感兴趣,积极操作但对于灭菌方法的判断还需学习。
授课主要内容或板书设计
学习项目1消毒灭菌方法及设备的认识
【引入】
本章需要掌握的基本技能是掌握控制微生物生长的消毒、防腐与灭菌方法及所用设备。
首先解决以下几个问题:
消毒、灭菌、防腐、化疗、无菌、无菌技术等基本概念的含义是什么?
物理消毒灭菌的常用方法及设备有那些?
化学消毒、灭菌、防腐的常用方法有那些?
要想达到好的控制微生物生长繁殖的效果应考虑那些影响因素?
一、消毒、灭菌、防腐、无菌、无菌技术等基本概念的含义是什么?
消毒:
指杀死病原微生物,但不包括芽胞。
灭菌:
是指杀灭物体上所有微生物,包括繁殖体和芽胞。
防腐:
是指防止或抑制微生物生长繁殖。
消毒剂:
高浓度
防腐剂:
低浓度
无菌:
物品中没有活的微生物存在。
无菌技术:
是指在进行外科手术或分离、转种及培养时防止其他微生物污染实验材料的操作方法。
无菌操作所用的器具和材料,都必须先经灭菌处理。
二、物理消毒灭菌的常用方法有那些?
热力灭菌法:
高温、低温、干燥
辐射杀菌法:
电离、非电离
物理方法
滤过除菌法
超声波杀菌法
等离子体
渗透压
(一)、热力灭菌法
分类:
干热灭菌法
湿热灭菌法
1.干热灭菌法
A焚烧与烧灼:
灭菌
焚烧其作用范围为污染纸张、垃圾等废弃物及动物尸体等;
灼烧一般用于可直接加热的仪器、器皿的灭菌,例如接种环、手术刀、镊子等金属器械及试管、三角瓶、小烧杯等。
注意事项如下。
(1)灼烧时要用酒精等外焰加热。
(2)灼烧接种环时,要不停捻动接种环的棒部,以便受热均匀,先烧环部,烧红、烧透,再烧柄部。
(3)灼烧试管、三角瓶、小烧杯等玻璃器皿时,要用灼烧过的镊子夹住仪器口壁,然后使器皿口朝上倾45º
,用酒精灯外焰从底部依次向上均匀加热(注意仪器内不能有水存留),最后烧灼管口、瓶口。
(4)纸片等易燃物品用灼烧法灭菌时,用无菌镊子夹住纸片,迅速在酒精灯外焰移动,以杀死微生物(注意纸的两侧应均匀灼烤),切忌烤糊。
B、干烤:
灭菌160°
~180℃,2h;
利用热辐射及干热空气进行灭菌,常用仪器是恒温干燥箱和干热灭菌箱。
使用恒温干燥箱的注意事项
(1)对玻璃器皿、瓷器、金属等耐热物品灭菌时,首先要洗干净、控干水,不能沾有油脂等有机物。
按要求包扎好后,放人恒温干燥箱内,排列不可过密、不可紧靠干燥箱壁,且忌用油纸包扎,以防着火。
然后调节温度到160~170℃持续2h以上,温度不要超过170℃。
(2)一般情况下对注射器、安瓿等灭菌时,180℃45min即可。
用l80℃2h或250℃45min可除去热原质。
(3)对纸张、棉花等物品及凡士林、部分粉剂等药品灭菌可用140℃,持续3h。
(4)灭菌时,干燥箱内物品不能堆放过多、过密,以防空气不易流通。
用纸包扎的待灭菌物,不可紧靠干燥箱壁,以防着火。
(5)灭菌开始前要调节好温度、时间,关好箱门,待温度慢慢升高。
灭菌结束时,关闭电源,温度慢慢降至60℃左右再开启箱门,以免高温度的玻璃因骤冷而破碎。
(6)干燥箱内有焦糊味应立即关闭电源,报告教师。
(7)取出灭菌物品时,小心不要碰破电热干燥箱顶部放置的温度计。
水银温度计打破后,立即报告老师,一定及时处理,防止水银蒸发中毒。
可先用硫磺铺撒在污染的地面和仪器上,然后用吸管清除水银。
C、红外线灭菌:
2.湿热灭菌法
A巴氏消毒法:
61.1-62.8℃,30min;
71.7℃,15-30sec
B煮沸消毒法:
100℃,5min-10min
C流通蒸气消毒法:
100℃,15-30min
D间歇蒸汽灭菌法:
100℃,15-30min,37℃过夜(3次)
E高压蒸气灭菌法:
高压蒸汽灭菌法是彻底而迅速的灭菌法。
适用范围:
①耐高温和潮湿的物品,如培养基、衣物、敷料、玻璃器材、传染性污染物等;
②接种及培养后的培养基,经高压蒸汽灭菌后,再弃去,然后洗涤相应容器。
高压蒸汽灭菌法需要的设备为:
高压蒸汽灭菌器。
高压蒸汽灭菌器的工作原理:
常压下,水的沸点是l00℃,随着容器里的压力升高,水的沸点也将升高,因此可以提高蒸汽的温度,人为使容器内的压力持续一定的时间,可达到彻底灭菌的目的。
使用高压蒸汽灭菌器要按要求操作,特别注意安全事项。
1.使用高压蒸汽灭菌器注意事项
(1)加水使用高压蒸汽灭菌器应注意仪器内水量充足,加水达到标识线。
(2)加料把灭菌物品疏松排列在高压蒸汽灭菌器内,保证空气畅通。
被灭菌的容器表面必须洁净且不污染有机物质,并用一定方法包扎,防止脱落。
盛装液体制剂的容器要耐高温、高压,并且保证器皿盖上有通气孔,使容器内外相通,如:
灭菌生理盐水时,在瓶盖上插一注射器针头可达容器内外气体相通的目的,保证容器不会因高压而损坏。
(3)加盖盖好灭菌器盖,拧紧加压装置,检查放气阀和安全阀,全自动仪器要设置好压力、温度、时间。
(4)排放冷空气加压之前先排除仪器内的冷空气,待灭菌器内有白色蒸汽持续冒出时,关上放气阀(全自动装置可忽略此环节)。
(5)灭菌实验室中常用的方法是:
I21.3℃,持续20min,可达到较好的灭菌效果。
不能耐受l21℃的含糖培养基或注射液可用116℃,持续40min或更长的时间达灭菌目的。
也可用126.5℃,15min达灭菌目的。
(6)开盖取物高压蒸汽灭菌结束时不要急于打开锅的压力阀,要等仪器内外压力平衡后(压力表将为零时)再打开压力阀,以免锅内液体喷溅伤人及灭菌器皿破裂。
(7)严密监控灭菌时不能离开工作现场,控制好灭菌压力,以防压力过高破坏培养基成分,防止高压锅超过耐压范围时爆炸伤人。
思考:
湿热比干热灭菌好的原因:
(1)细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性
(2)湿热穿透力强
(3)湿热蒸气有潜热存在,水蒸气凝固成水释放潜热,迅速提高被灭菌物体的温度
(二)、光线与射线的消毒作用
1.日光与紫外线
机理:
损坏DNA构型->
细菌死亡或变异
特点:
穿透力弱
2.电离辐射:
包括X射线和γ射线
机制:
干扰DNA的合成;
破坏细胞膜;
产生过氧化氢等
穿透力强,不升高温度
(三)、滤过除菌法
用滤菌器除去液体及空气中的细菌
用于不耐热的血清、毒素、抗生素
(四)、超声波的消毒作用
可裂解细菌,尤其对G+更敏感
主要用于粉碎细胞,提取细胞组分或制备抗原等
(五)等离子体法
对微生物有良好的杀灭作用。
但不适用于纺织品和液体。
三、化学消毒灭菌的常用方法有那些?
消毒剂
防腐剂
化学方法化学治疗剂
(一)化学消毒灭菌的机制
①使菌体蛋白质变性或凝固
②破坏或改变蛋白质与核酸功能基团
③改变细胞壁的通透性
(二)常用消毒剂的主要种类、浓度及用途
1.酚类:
作用:
菌体蛋白凝固;
损伤细胞膜;
灭活酶类浓度:
石炭酸为3%-5%、来苏儿为2%
用途:
地面、器具表面和皮肤的消毒
2.醇类:
作用机制:
使菌体蛋白变性与凝固;
干扰细菌代谢
浓度:
乙醇70%-75%用途:
用于皮肤的消毒和体温计等的浸泡
3.重金属盐类:
使细菌发生变性和沉淀;
酶活性丧失
(1)2%红汞:
皮肤、粘膜和小创伤
(2)0.05-0.01%升汞:
非金属器皿
4.氧化剂:
氧化作用;
使蛋白质变性
(1)0.1%高锰酸钾:
皮肤、尿道、水果
(2)3%过氧化氢:
创伤、皮肤粘膜
(3)2%-2.5%碘酒:
皮肤消毒
(4)0.2ppm-0.5ppm氯:
饮水和游泳池
(5)10%-20%漂白粉:
地面、厕所等
5.表面活性剂:
灭活氧化酶等酶的活性;
蛋白质沉淀
(1)0.05%-0.1%新洁尔灭:
皮肤粘膜、手术器械
(2)0.05%-0.1%杜灭芬:
伤口冲洗,金属器械、塑料、橡皮类
6.烷化剂:
使菌体蛋白和核酸的烷基化
(1)10%甲醛:
物品表面、空气
(2)2%戊二醛:
精密仪器、内窥镜等缺点:
有一定的毒性
(三)日常消毒剂的应用
1.病人的排泄物:
等量的20%漂白粉、5%石炭酸或2%来苏儿、搅拌均匀,作用2小时
2.皮肤:
2.5%碘酒、70%酒精、2%红汞
3.粘膜:
1%硝酸银、3%过氧化氢、0.1%高锰酸钾等
4.饮水:
氯气、漂白粉
5.厕所:
生石灰
6.空气:
甲醛熏蒸
7.手:
2%来苏儿、2%碘酊、70%酒精
(四)常用防腐剂
1.概念:
可抑制霉腐微生物的生长繁殖,防止食品等发生霉变的措施,此时,微生物并没有被杀灭,而只是受到抑制。
而添加防腐剂也是一种常用的防腐措施。
2.常见防腐剂:
乳酸链球菌肽
,又称乳酸链球菌素,苯甲酸和苯甲酸钠;
硝酸盐和亚硝酸盐等。
四、影响消毒灭菌的因素
a.消毒剂的性质、浓度与作用时间
b.微生物的种类与数量
c.温度
d.酸碱度
e.有机物
五、分组讨论
判断下列物品采用何种消毒灭菌方法较为合适?
这些消毒灭菌方法分别需要什么设备或试剂?
如何操作?
接种环、牛奶、酶制剂、实验服、无菌室、培养皿、饮水、皮肤、一般培养基
微生物实训室
2
学习项目2微生物实验器具的基本清洗包扎技术
技能目标1.能安全配制出符合要求的洗涤剂并正确使用
2.能熟练、迅速地包扎好各种玻璃器皿
具体的操作及注意事项
包扎的正确操作
演示法、分组讨论和分组实训法
移液管、培养皿等仪器
微生物实训手册
实训报告
对于玻璃仪器的包扎需要反复练习,个别同学接受能力欠缺,需
要加强联系。
【复习引入】上一个学习项目为消毒灭菌,那么在消毒灭菌之前我们要对各种器皿进行清洗包扎,那么如何进行清洗包扎就是本次学习的主要任务。
一、常用洗涤液及其配制方法
(一)配制洗涤剂的常用试剂
重铬酸钾(工业用)、浓硫酸、氢氧化钠溶液(0.1mol/L)、碳酸钠水溶液(苏打水)、氨水、酒精(95%)、苯酚溶液(0.5%,5%)、浓硝酸、漂白粉液、蒸馏水、肥皂、氢氧化钾溶液(0.1mol/L)、盐酸溶液(10%,0.1mol/L)。
1.铬酸洗涤液的配制与使用
(1)配方
浓配方:
重铬酸钾(工业用)40g稀配方:
重铬酸钾(工业用)50g
浓硫酸(粗)500mL浓硫酸(粗)lOOmL
自来水160mL自来水850mL
(2)配制与使用方法
将重铬酸钾溶解在自来水中,慢慢加入浓硫酸,边加边搅拌,配好后,贮存于广口的玻璃瓶内,盖紧塞子备用。
应用此液时,器皿必须干燥,同时切忌把大量还原物质带入,这样就可应用多次,直到溶液呈青褐色为止。
在使用时,为增加去污作用,稀的铬酸洗涤液可以煮沸使用。
2.酸和碱的配制及使用
若器皿上沾有焦油和树脂等物质,可用浓硫酸或40%的氢氧化钠溶液使它们溶解后洗去,一般只需5~10min,有时需数小时。
3.肥皂和其他洗涤剂的使用
肥皂水是很好的去污剂,加热后去污力更强。
油脂太多的器皿,先用吸水纸将油擦去后,再用肥皂水洗。
此外还有其他洗涤剂如l0%的磷酸钠溶液去污、去油脂能力更强。
比用肥皂洗更加洁净。
二、玻璃器皿的准备与清洗
1.新购置的器皿
对于新购置的玻璃器皿最好的清洗办法是用l0%的盐酸溶液浸泡一夜再用清水洗净;
也可浸在肥皂水中lh,再用清水洗净。
2.一般器皿
(1)一般器皿如试管、烧杯、培养皿等,若沾有有害微生物,先用高压灭菌锅灭菌或用漂白粉溶液消毒后,再用水洗。
(2)用肥皂水洗时,可以加热煮沸,洗过之后用清水冲洗几次,最后用少量蒸馏水洗一次,器皿干燥后就会更加洁净、光亮。
(3)若需更洁净的器皿,可用浓铬酸洗液处理。
试管、烧杯、培养皿等在铬酸洗液中浸10min,滴定管、吸管和移液管则要1~2h。
洗液处理后的玻璃器皿,要用水充分冲洗,将洗液完全洗去,最后用少量蒸馏水再洗一次。
3.载玻片与盖玻片
已用过的带有活菌的载玻片与盖玻片,可先浸在5%的苯酚溶液中消毒,然后用水冲洗干净,水洗后在铬酸洗涤液中浸数小时后再用水洗几次。
若载玻片和盖玻片上沾有油脂等物质,可先用肥皂水煮过后再洗。
洗净的载玻片与盖玻片,可贮在95%的酒精(滴入少量浓盐酸)中,用时可用柔软洁净的布擦干或将酒精烧去。
4.滴定管、吸管和移液管
带菌的滴定管、吸管和移液管等,应立即投入5%苯酚溶液中过夜,先进行灭菌。
然后用自来水冲洗,再用蒸馏水冲净。
不带菌的可直接清洗。
5.特殊清洁法
精密的实验,只将玻璃表面附着物洗去还不够,玻璃中的可溶性杂质也影响实验验结果。
这些玻璃器皿,可先在0.1mol/L的氢氧化钾溶液或0.lmol/L的氢氧化钠溶液中煮1h,洗过后再在0.1mol/L的硫酸或0.1mol/L的盐酸溶液中煮1h。
然后再用蒸馏水洗几次,再在蒸馏水中浸几小时后干燥。
三、玻璃器皿的干燥
洗净后的玻璃器皿,一般是放在木架上或其他合适的地方,在室温下干燥。
若需要高温干燥,温度一般在80~100℃为宜。
压缩空气吹干比较快,但压缩空气不太洁净,需要很干净的器皿时不宜用。
若需快速干燥,可将洗净的玻璃器皿先用少许无水酒精润湿,倒去后再加少许乙醚,任其干燥。
四、玻璃器皿的包扎
洗净的玻璃器皿,有些还需在电烤箱中进行干燥,灭菌前需要包扎。
1.培养皿
培养皿可单独用纸包装,也可几套培养皿一起用纸包装。
2.试管、烧杯、锥形瓶
试管、锥形瓶先加棉塞,烧杯口加盖6~8层纱布,最后用纸包扎后在电烤箱中进行干热灭菌。
3.移液管
为防止细菌进入口中,并避免将口中细菌吹入移液管内,移液管应在距管口1~2mm处用铁丝塞入棉花少许(约4~5cm长)。
棉花要塞得松紧适宜,吹时能通气但棉花不滑下去。
将塞好棉花的移液管尖端,放在4~5cm宽的纸条一端约成45º
角,折叠纸条包住尖端,用左手捏住移液管,右手将移液管压紧,在桌面上向前搓转,每只移液管分别以螺旋式包扎起来。
上端剩余纸条折叠打结,放在电烤箱中准备灭菌(图1-5)。
四、教学组织:
实训2-3人一组,教师认真讲解操作规程,边讲解边示范,学生理解、操作,在学生基本清楚的下,教师进行分别指导教学。
五、总结与评价:
采用同学之间的评价、示范和老师的综合评价。
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