转录和转录水平的调控要点Word文档下载推荐.docx
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和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控转录的作用,统称为反式作用因子。
反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子(TF),相应于RNA—polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。
TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多种及其亚类。
基本概念:
1.不对称转录:
两重含义,一是指双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);
二是对不同基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链,即模板链并非永远在同一单链上。
2.编码链:
DNA双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由T代替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名.
3.σ(sigma)因子:
原核生物RNA聚合酶全酶的成份,功能是辨认转录起始区,这种σ因子称σ70,此外还有分子量不同,功能不同的其他σ因子。
基本要求:
掌握转录与复制的区别,转录的不对称性,原核生物的RNA聚合酶的组成及各亚基的功能,真核生物RNA聚合酶的分类、性质及功能,原核生物启动子的结构特点,了解真核生物RNA聚合酶的组成,研究转录起始区的方法。
二.转录过程
1.转录起始:
转录的起始就是生成由RNA聚合酶,模板和转录5’端首位核苷酸组成的起始复合物。
原核生物RNA5’端是嘌呤核苷酸(A、G),而且保留三磷酸核苷的结构,所以其起始复合物是:
pppG-DNA-RNA聚合酶。
真核生物起始,生成起始前复合物(PIC).例如RNA—pol-Ⅱ转录,是由各种TFⅡ相互辨认结合,再与RNA聚合酶结合,并通过TF结合到TATA盒上。
2.转录延长:
转录的延长是以首位核苷酸的3’-OH为基础逐个加人NTP即形成磷酸二醋键,使RNA逐步从5'
向3'
端生长的过程.在原核生物,因为没有细胞膜的分隔,转录未完成即已开始翻译,而且在同一DNA模板上同时进行多个转录过程。
电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上的小黑点(多聚核糖体),是转录和翻译高效率的直观表现。
3.录终止:
转录的终止在原核生物分为依赖Rho因子与非依赖Rho因子两类.Rho因子有ATP酶和解螺旋酶两种活性,因此能结合转录产物的3’末端区并使转录停顿及产物RNA脱离DNA模板.非依赖Rho因子的转录终止,其RNA产物3’-端往往形成茎环结构,其后又有一串寡聚U.茎环结构可使因子聚合酶变构而不再前移,寡聚U则有利于RNA不再依附DNA模板链而脱出.因此无论哪一种转录终止都有RNA聚合酶停顿和RNA产物脱出这两个必要过程.真核生物转录终止是和加尾(mRNA的聚腺昔酸polyA)修饰同步进行的。
RNA上的加尾修饰点结构特征是有AAAUAA序列.
1.转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC):
是真核生物转录因子与RNA聚合酶一同结合于转录起始前的DNA区域而成的复合物。
2.加尾修饰点:
真核生物mRNA转录不是在mRNA的位置上终止,而是在数百个核苷酸之后,研究发现在编码链读码框架的3'
端之后,常有一组共同序列AATAAA,再下游还有相当多GC的序列,这些序列称为加尾修饰点,转录越过修饰点后,mRNA在修饰点处被切断,随即加入polyA。
3.Rho因子:
是原核生物转录终止因子,有ATP酶和解螺旋酶活性.转录终止也可不依赖Rho因子.
基本要求:
掌握原核生物的转录起始复合物的形成过程,真核生物转录起始及起始前复合物(PIC)的生成,RNA聚合酶Ⅱ催化的转录起始过程中各种TFⅡ的作用,转录延伸过程中的化学反应,原核生物的转录终止的两种形式,真核生物的转录终止的修饰点.了解原核生物RNA聚合酶的各种亚基与真核生物的各种转录因子之间的关系即拼版理论,原核生物转录空泡的形成及转录产物的释放过程。
三.真核RNA的转录后加工
1.mRNA转录后加工
真核生物转录生成的RNA,多需经加工后才具备活性,这一过程称为转录后修饰,mRNA转录后修饰包括首、尾修饰和剪接。
加尾修饰是和转录终止同步的,5’端修饰主要是指生成帽子结构,即把5'
—pppG转变为5'
—pmGpppG.其过程需磷酸解、磷酸化和碱基的甲基化。
mRNA由hRNA加工而成。
真核生物基因由内含子隔断编码序列的外显子,是断裂基因。
内含子一般也出现在转录初级产物hRNA。
切除内含子,把外显子连结在一起,就是剪接加工.在电镜下看到加工过程,内含子往往被弯曲成套索状,因此称为套索RNA。
现在知道剪接加工中,需要由多种Sn—RNA与蛋白质共同组成的并接体.并接体和hnRNA上的内含子边界序列辨认结合。
剪接过程先由含鸟苷酸的酶提供3’-OH对其中内含子5’-端的磷酸二酯键作亲电子攻击使其断裂。
断裂的外显子3’-OH对内含子3'
-端的磷酸二酯键作亲电子攻击,使刚断出的外显子完全置换了内含子,两个外显子就相连起来,因此这个过程称二次转酯反应。
2.tRNA转录后加工
tRNA的转录后修饰,除了剪接加工外,还包括tRNA链上稀有碱基的形成,以及加上3’端的CCA序列。
3.rRNA的转录后加工
rRNA加工多采用自我剪接的形式。
自我剪接的RNA本身形成一种特别的二级结构,称为锤头结构。
锤头结构是指复合的茎环组成形态,但其中某些序列上必需是特定的碱基所占据。
这种RNA结构,不需要任何蛋白质,就可以水解RNA链上某一特定位点的磷酸二酯键。
也就是说,这是一种起催化作用的RNA,现称为核酶。
核酶的发现,对酶学、分子生物学,进化生物学都是重要的理论更新,而且,医学上已开始利用人工设计的核酶,去消灭一些作为病原体的RNA病毒或消除一些不利于生命活动的细胞内RNA。
1.剪接修饰:
RNA转录初级产物含有非编码组分,通过剪接除去非编码组分,把编码组份连接起来。
剪接修饰最常见的是靠并接体协助的二次转酯反应,此外还可有自我剪接及需酶的剪接等剪接方式。
2。
外显子:
定义为断裂基因上及其转录初级产物上可表达的序列.或转录初级产物上通过拼接作用而保留于成熟的RNA中的核苷酸序列或基因中与成熟RNA相对应的DNA序列.
3。
内含子:
早期定义为核酸上的非编码序列.随着内含子功能的被拓宽,建议用"
转录初级产物上通过拼接作用而被去除的RNA序列或基因中与这种RNA序列相对应的DNA序列”较全面.
4。
并接体:
由snRNA和蛋白质组成的核糖核酸蛋白(核蛋白)复合物。
其功能是结合内含子两端的边界序列,协助RNA的剪接加工。
5。
核酶(ribozyme):
具有催化功能(酶的作用)的RNA分子。
核酶能起作用的结构,至少含有3个茎(RNA分子内配对形成的局部双链),1至3个环(RNA分子局部双链鼓出的单链)和至少有13个一致性的碱基位点。
掌握真核生物mRNA转录后5ˊ—端加帽;
3ˊ-端加尾及mRNA链进行剪接修饰,tRNA及rRNA的转录后加工过程,了解内含子的其他剪接方式及功能,核酶的应用。
转录水平的调控
一、基因表达调控基本概念与原理
1、基因表达的概念基因是一段DNA分子,编码一种多肽链或RNA。
基因通过转录和翻译产生具有一定功能的蛋白质的过程。
大多数基因的表达产物是蛋白质,部分基因如rRNA和tRNA基因的表达产物是RNA。
2、基因表达的特点(A)、时间特异性或发育阶段特异性、(B)、空间特异性或组织细胞特异性,(C)、有两种表达方式,管家基因几乎在所有的细胞和所有的发育阶段持续表达,基本不受环境因素的影响,只受启动子调节。
另外一些基因的表达受环境因素的诱导或阻遏.(D)、基因表达可在多层次上受到调节如基因、转录、转录后加工翻译和翻译后加工等水平上进行调节。
但最主要的是转录水平的调节,本章讨论的内容是原核基因和真核基因转录水平的调节。
3、基因转录激活的基本要素:
(A)、特异的DNA调节序列是调节基因转录的DNA片段,如原核生物操纵子调控区中的启动序列、操纵序列、CAP蛋白结合位点和真核基因的启动子、增强子和沉默子等。
(B)、调节蛋白是调节基因转录的蛋白因子,如原核生物的阻遏蛋白和CAp蛋白、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。
、(C)、RNA聚合酶是催化基因转录最主要的酶.原核生物只有一种RNA聚合酶,催化所有RNA的转录。
真核生物有三种RNA聚合酶,催化不同RNA的转录。
DNA调节元件和调节蛋白可以通过影响RNA聚合酶的活性来调接基因转录激活.
二、原核基因转录调控
1.原核基因表达调节的特点:
(A)σ因子决定RNA聚合酶识别特异性,帮助RNA聚合酶识别不同启动子,对不同基因进行转录。
(B)、转录调节普遍采用操纵子模式,原核生物功能相关的基因往往串联地排列在一起,在一个共同的调控区的调节下,一起转录生成一个多顺反子,最终表达产物是一些功能相关的酶或蛋白质,它们-起参与某种底物的代谢或某种产物的合成。
(C)、阻遏蛋白对转录的抑制作用是普遍存在的贡性调节.
2、乳糖操纵子的结构、负性和正性调节及协调调节:
(A)、乳糖操纵子包括三个结构基因(Z、Y、A)、三个调节序列:
启动序列、操纵序列和CAP蛋白结合位点,以及一个调节基因,调节基因编码阻遏蛋白。
(B)、阻遏蛋白的负性调节蛋白质与DNA结合抑制基因的转录属于负性调节。
操纵序列是控制操纵子中结构基因转录的开关,阻遏蛋白与操纵序列结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录.当乳糖存在时,乳糖的分鲜产物半乳糖与阻遏蛋白结合,导致阻遏蛋白与操纵序列解离,诱导基因的转录。
(C)、CAP的正性调节蛋白质与DNA结合增强基因转录属于正性调节.在启动子上游子存在CAP结合位点,CAP与其结合后可促进RNA聚合酶与启动秀列结合,从而促进转录.但是,CAP单独不能与其位点结合,只有与cAMP形成复合物后才能与CAP位点结合。
细胞内葡萄糖缺乏时,cAMP水平升高,cAMP一CAP复合物形成并与CAP结合位点结合,促进RNA聚合酶与启动序列结合并启动转录。
葡萄糖丰富时,cAMP水平降低,cAMP一CAMP复合物不能形成,CAP不能与DNA结合,不能启动转录。
(D)、协调调节即阻遏蛋白的负性调节与CAP蛋白正性调节的协同作用。
当阻遏蛋白与操纵序列结合封闭转录后,CAP不能启动转录,但是阻遏蛋白脱离操纵序列而解除封闭后,如果没有CAp的作用也不能启动转录,所以乳糖操子的诱导作用即需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。
3、操纵子的其他转录调节机制
(A)、转录衰减作用最早在阻遏型的色氨酸操纵子发现,当色氨酸丰富时,核蛋白体迅速通过前导编码序列!
、使后面的序列形成衰减子,导致RNA聚合酶的脱落和转录终止.转录衰减实质上是转录和前导肽翻译过程的偶联,,是原核生物特有的转录调节机制。
(B)、S0S反应是大肠杆菌特有的一种DNA损伤修复机制.参与DNA损伤修复的一些S0S基因受一个共同的LexA阻遏蛋白的控制,正常情况下LexA与DNA结合阻止了这些基因的表达,当紫外线照射造成DNA损伤时,Rec蛋白产生蛋白水解酶活性,使LexA蛋白水解失活,导致S0S基因转录表达,并对损伤的DNA进行修复
三、真核基因转录调节
真核基因数量多,基因表达调节机制复杂,基因表达可在DNA、染色质、转录、转录后加工、翻译和翻译后加工等水平上调节,但最主要的是转录水平的调节.
1、真核基因组结构特点(A)、真核基因组结构庞大,由30亿碱基对组成,有4万多个基因。
(B)、单顺反子真核细胞一般以一个基因为转录单位,转录产物是单顺反子、即编码一种多肽的mRNA。
(C)、重复序列真核基因组中编码序列只占5一10%,其余80-90%是非编码序列,其中有大量的重复序列.重复序列长短不同,重复率不等,而且具有种属特异性。
(D)、基因不连续性真核基因的编码序列不连续排列,被一些非编码序列间隔开,编码序列称外显子,非编码序列称内含子.
2、真核基因表达调节特点(A)RNA聚合酶原核生物只有一种RNA聚合酶,真核生物有三种,分别转录不同的RNA,RNA聚合酶II负责转录蛋白质的基因,因此该酶最为重要。
(B)活性染色质结构的变化基因转录可在染色质水平上调节,基因转录激活的染色质在结构和性质上发生如下变化;
(1)由于转录激活区组蛋白部分脱落,产生DNaseI超敏位点。
(2)DNA拓扑构像发生变化,DNA转录时,RNA聚合酶的前面是正超螺旋,后面是负螺旋。
(3)DNA碱基修饰变化转录激活的基因处于低甲基化状态。
(4)组蛋白的数量、结构和化学修饰发生变化(C)正性调节占主导地位蛋白质与DNA结合抑制转录是负性调节,蛋白质与DNA结合后促进基因转录是正性调节。
在原核生物中阻遏蛋白与DNA结合抑制转录是负性调节。
在真核生物中有许多转录激活因子,它们与增强子DNA结合促进转录属于正性调节。
3、真核基因转录激活调节真核基因转录激活也需要DNA调节序列、调节蛋白和RNA聚合酶三大要素。
(A)顺式作用元件真核生物的DNA调控元件称为顺式作用元件,包括启动子,增强子和沉默子.它们通过DNA和蛋白质、蛋白质和蛋白质的相互作用,最终改变RNA聚合酶的活性而调节转录。
典型的启动子由TATA盒及其上游的GC盒和CAAT盒组成。
增强子是远离启动子的、可促进转录的调控元件,其作用与方向和位置无关,而且具有组织特异性。
它一般与转录激活因子结合,通过作用于转录起始复合物增强RNA聚合酶的活性,从而促进转录.沉默子是一种负性调控元件,它与转录抑制因子结合抑制转录。
(B)反式作用因子是影响基因转录的调节蛋白,包括基本转录因子和特异转录因子,基本转录因子与RNA聚合酶构成转录起始复合物,有人将它们称为RNA聚合酶的亚基,它们在所有的细胞中都存在,对于三种RNA聚合酶,除个别基本转录因子都是通用的.特异转录录因子包括转录激活因子和转录抑制因子,前者与增强子结合增强基因转录,后者与沉默子结合抑制基因转录。
转录因子一般含有DNA结合域和转录激活域,前者是转录因子与DNA结合的位点,如锌指结构和碱性氨基酸组成的螺旋.后者是转录因子与转录起始复合物中某种蛋白质相互作用的位点,此外,某些转录因子还有蛋白质和蛋白质相互的结构域
4、mRNA基因转录激活及其调节mRNA基因是蛋白质基因,在基因组中占据绝大多数,由RNA聚合酶II转录,真核RNA聚合酶II与十几种基本转录因子结合成转录起始复合物,对蛋白质基因进行转录。
基本转录因子中只有TFIID可以和TATA盒结合。
TFIID由TBP(TATA结合蛋白)和十几种TBP相关因子(TAF)构成。
真核基因调节的三大要素是顺式作用元件反式作用因子和RNA聚合酶,它们通过DNA和蛋白质及蛋白质和蛋白质的相互作用调节的转录。
例如一种转录激活因子和某种增强子结合,通过作用于转录起始复合物中的某种蛋白质引起RNA聚合酶的构想改变或化学修饰,最终导致其活性增加,从而激活转录.虽然增强子距离启动子和RNA聚合酶很远,但是DNA可以弯曲,使转录激活因子与启动子上的转录起始复合物靠近,与复合物中的某种蛋白质(TBP或TAF)相互作用,然后通过它作用于RNA聚合酶,从而激活转录.
SECTION6蛋白质的生物合成及表达定位
蛋白质合成的反应体系、三种RNA在翻译中的作用、蛋白质合成过程可分为起始、延长、终止三个阶段。
原核生物翻译起始与真核生物的区别。
肽链合成后的加工修饰。
蛋白质生物合成的干扰和抑制。
难点:
遗传密码的特性、翻译起始复合物的形成、肽链延长阶段的三个步骤、蛋白质的靶向输送。
一.参与蛋白质生物合成的物质
要点:
参与翻译过程的物质:
需要20种氨基酸作为原料、三种RNA、蛋白质因子(起始因子IF、延长因子EF及释放因子RF)、酶和ATP、GTP等,共同协调完成蛋白质合成。
1.mRNA是翻译的直接模板
mRNA每3个碱基组成三联体密码子,决定一个氨基酸的信息.有64个密码子,其中mRNA5’端的AUG称为起始密码。
UAG、UAA、UGA为肽链合成的终止信号,其余61个密码子代表20种氨基酸。
密码阅读方向是从5’到3’,决定翻译的方向性。
遗传密码有以下生物特性:
(1)遗传密码的连续性,即从AUG开始,各密码子连续阅读而无间断,若有碱基插入或缺失,会造成框移突变;
(2)简并性,大部分氨基酸有多个密码子,以2~4个居多,可有6个。
这种由多种密码编码一种氨基酸的现象称为简并性.决定同一种氨基酸密码子的头两个碱基是相同的,第三位碱基不同,第三位碱基发生点突变时仍可翻译出正常的氨基酸;
(3)摆动性,mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码严格配对。
而密码第三位碱基与反密码第一位碱基不严格遵守配对规则,称为密码配对的摆动性。
见表1—1。
表1—1密码子、反密码子配对的摆动现象
tRNA反密码子第一个碱基
I
U
C
A
G
mRNA密码子第三个碱基
U,C,A
A,G
U,C
(4)通用性,生物体的遗传密码相同,称密码的普遍性。
但线粒体密码子有例外.如AUA与AUG均代表Met和起始密码子;
UGA为Trp密码子而不是终止密码子等。
2.核蛋白体是肽链合成的场所
核蛋白体由大、小亚基构成,每个亚基含不同的蛋白质和rRNA。
大亚基有转肽酶活性,有容纳tRNA的二个部位:
A位,即氨基酰位,P位,即肽酰位。
3.tRNA和氨基酰—tRNA
tRNA的作用是携带并转运特异氨基酸。
tRNA分子上3’端的CCA序列是结合氨基酸的部位,反密码环可特异识别mRNA的密码序列。
(1)氨基酰-tRNA合成酶。
氨基酰-tRNA合成酶可高度特异识别氨基酸及tRNA底物,保证各氨基酸与相应数种tRNA准确结合。
氨基酸—tRNA合成酶催化的反应分为两步:
氨基酸+ATP-E───→氨基酸—AMP—E+PPi
氨基酰—AMP-E+tRNA───→氨基酰—tRNA+AMP+E
此反应使氨基酸羧基活化,并使活化氨基酸转移到tRNA3'
端CCA-OH,形成氨基酸的活性形式,氨基酰—tRNA.
(2)氨基酰-tRNA的表示方法
原核细胞tRNA携带的甲硫氨酸可被甲酰化,称tRNAifmet,fMet—tRNAifmet专一识别起始密码AUG,第一个进入核蛋白体循环。
甲酰转移酶
N10-甲酰四氢叶酸+Met-tRNAifmet─────→四氢叶酸+fMet—tRNAifmet
1.熟悉遗传密码的生物特性。
2.掌握氨基酰-tRNA合成酶的催化活性及特异性.
3.掌握三种RNA在蛋白质合成中的功能。
基本概念:
1.遗传密码:
模板上的核苷酸,三个为一组(三联体)决定一个氨基酸的种类,称为三联体密码.密码也决定蛋白质的一级结构。
2.翻译:
蛋白质生物合成称为翻译,是指把核苷酸序列组成的遗传信息,破读为蛋白质分子的氨基酸排列顺序.
二。
蛋白质生物合成过程
要点:
翻译过程可分为起始、延长、终止三个阶段,蛋白质合成在核蛋白体上进行称为核蛋白体循环(广义).肽链的合成是从N端到C端.
1。
翻译起始(原核生物)
生成由起始氨基酰-tRNA、mRNA和核蛋白体组成的70S起始复合物,原核生物的起始因子(IF)有三种。
其过程在原核生物和真核大同小异。
(1)核蛋白体大、小亚基分离。
(2)mRNA结合小亚基mRNA起始密码上游为S-D序列,可与小亚基16SrRNA3’端互补.紧接S-D序列的短核苷酸序列可被小亚基蛋白识别结合,两方面作用促使mRNA在小亚基上定位.
(3)fmet—tRNAifmet结合于mRNA—小亚基复合体的AUG上,形成30S起始复合体。
(4)大亚基加入30S起始复合体,形成70S起始复合体。
1.1真核生物翻译起始的特点
真核生物核蛋白体为80S(60S+40S)。
10种起始因子(eIF),见下表.
表1-2各种起始因子在形成起始复合物中的作用
生成起始复合物步骤
IF
eIF
亚基分离
起始tRNA就位
mRNA就位
大亚基结合
IF—3、IF-1
IF-2、IF—1
核酸-核酸、核酸-蛋白质之间的辨认结合
各种IF脱落,GTP水解
eIF-3、eIF-3A、eIF—4C
eIF-2、eIF2B、eIF—3、eIF-4C
eIF-4、eIF—4A、eIF—4B、eIF-4E、eIF-4F
(1).真核起始甲硫氨酸不需甲酰化.
(2)。
真核mRNA没有S—D序列,但5'
端帽子结构与其在核蛋白体就位相关。
帽结合蛋白(CBP)可与mRNA帽子结合,促进mRNA与小亚基结合。
2.肽链的延长
延长阶段为不断循环进行的过程,也称核蛋白体循环。
分为进位、成肽和转位三个步骤。
真核及原核生物的延长,主要是延长因子体系的不同,见表1-3。
表1-3真核和原核生物延长因子及其功能
原核生物
功能
真核生物
EFTu
EFTs
EFG
协助氨基酰-tRNA进入A位,结合GTP
从EFTu中置换GDP
转位酶,促助肽酰-tRNA由A位进至P位,协助tRNA的释放
EF1α
EF1β、EF1γ
EF2
(1)进位
根据A位上密码引导,相应的氨基酰-tRNA进入A位,称为进位(注册)。
EF-T由EF—Tu和EF-Ts两个亚基组成,EF—Tu-GTP与氨基酰-tRNA形成氨基酰—tRNA—Tu-GTP三元复合物并进入A位,消耗GTP完成进位,释出EF-Tu-GDP,EF—Ts促进EF—Tu释出GDP,并重新形成EF—T,再次被利用.
(2)成肽
转肽酶催化催化P位上甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移给A位上进入的氨基酰-tRNA,形成肽键连接,生成的二肽酰—tRNA占据A位,P位连有空载tRNA,将迅速从核
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