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高致病性禽流感以其高致病性和高致死率为特征,常常引起禽群的全军覆没,给养禽业带来了巨大的经济损失。
近年来,不时发生禽流感病毒感染人的事件,禽流感已具有突出的公共卫生意义。
受体是限制流感病毒跨种间传播的天然屏障,对于禽流感这样的跨物种传播的疾病来说,研究受体可揭示流感病毒如何选择物种及其跨越物种传播的分子机制,对研究防治禽流感的药物和防止新型流感的爆发具有十分重要的意义。
病毒覆盖蛋白结合法是研究病毒受体的常用方法。
犬瘟热病毒、麻疹病毒、伪狂犬病毒、登革病毒、狂犬病毒、牛病毒性腹泻病病毒、新城疫病毒等病毒受体的研究均已通过该法获得成功。
本实验利用经典的病毒覆盖蛋白结合法对鸡胚成纤维细胞膜上的禽流感受体进行初步鉴定,在提取的细胞膜蛋白中发现了8条疑似病毒受体的条带,为进一步研究流感病毒感染宿主细胞的分子机制打下了基础。
关键词:
禽流感病毒鸡胚成纤维细胞受体病毒覆盖蛋白结合法
ABSTRACT
Influenzaisthemostwidelydistributedanthropozoonosisontheearth.TheabroadHostrangofInfluenzavirusarehumanbingsandvarietykindofanimals.AvianInfluenza(AI)isastonginfectiousdiseaseofbirdsthatcausedbyavaininfluenzaAvirus(AIV).HighlyPathogenicAvianInfluenza(HPAI)usuallycausesagroupofbirdscompletelydiedbecauseofitshighpathogenicityandhighfatalityrate.Inrecentyears,therewereeventsthatAIVinfectedsomepeople.Thus,AIVsiprobidedwithitsobviousmeaningintheDepartmentofPublicHealth.Thereceptorsarenaturalcoverfordefensethatrestrictinfluenzavirusspreadamongspecies.ForAI,researchingreceptorscouldexposehowAIVchoosespeciesandthemolecularmechanismofspreadingamongspecis,boostthemedicinalresearchofpreventionandcure,andtopreventnewlyinfluenzaoutbreak.Virusoverlayproteinblotassay(VOPBA)isthecommonmethodtoresearchthereceptorsofvirus.SuchasCanineDistemperVirus,MeaslesVirus,PseudoRabiesVirus,DengueVirus,RabiesVirus,BovineViralDisrrhea-mucosalVirus,NewcastleDiseaseVirus,aresuccessfullyidentifiedbythismethod.Inthiscontext,weinitiallyidentifiedthereceptorproteinsofAIVonchickenembryofibroblast(CEF)cellsbyVOPBA,intheCEFmembraneproteinswefound8doubtfulAIVreceptors,providingsomeevidenceforfurtherstudyofmolecularmechanismofinfectionbyIV.
Keywords:
AvianInfluenzaVirus,CEF,Receptors,VOPBA
第一章前言
第一节禽流感概述
流行性感冒,简称流感,是一种由RNA病毒引起的急性呼吸道感染,传染性强、传播速度快,是地球上分布最广的人畜共患传染病,在世界各地常会有周期性的大流行。
据统计,每年大约有3000万~5000万人感染流感引起严重的呼吸道疾病,甚至有数百万人因此而死亡。
流感病毒属于正黏病毒科,分为A(甲)、B(乙)、C(丙)3个型。
其中,A型流感病毒常感染禽类,一些亚型也可感染其他哺乳动物及人类;
B型和C型流感病毒主要感染猪和海豹。
三型流感病毒的内部核蛋白和基质蛋白的抗原性有很大不同,在基因组结构和致病性方面也存在很大差异。
禽流感是由A型流感病毒引起禽类的一种烈性传染病,感染家禽后引起各种综合征,从无临诊症状感染到轻度上呼吸道疾病,精神萎靡,食欲减退,产蛋下降,甚至急性高度致死性疾病。
AIV几乎存在于所有家禽和野禽,分布于全世界。
水禽是A型流感病毒主要的带毒者,几乎所有血清型都已在水禽体内分离到。
高致病性禽流感尤以其高致病性和高死亡率,威胁着集约化养禽业的发展,成为养禽业的头号大敌。
并且,禽流感病毒感染人类的事件已屡见不鲜,本世纪初又成为继SARS后又一威胁人类安全的重要疾病,曾一度引起社会恐慌。
当前,禽流感已被国际兽医局定为A类传染病,同时被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。
A型流感病毒有许多亚型。
其囊膜上的血凝素(HA)有16个亚型;
神经氨酸酶(NA)有9个亚型。
HA与NA亚型之间的不同组合,使得A型流感病毒亚型繁多,再加上基因突变、重组和重排,使其变异极快,导致毒株的致病性也千差万别。
高致病性AIV以H5和H7血清亚型为主,一些低致病性毒株引起的流行往往也能演变为高致病性。
血清学调查发现,H9亚型的禽流感在我国广泛存在,是目前影响我国养禽业的主要禽流感亚型,也已在人体内分离到H9型毒株。
每一次禽流感的爆发都会直接或间接给人类带来巨大打击。
90年代以前,禽流感的大爆发就有八次,分别是苏格兰的H5N1、英国的H7N3、澳大利亚的H7N7、英国的H5N2、冰岛的H5N8、美国的H5N2、美国的H7N7、冰岛的H5N1[1]。
进入90年代以来,国内外也频频出现关于禽流感爆发的报道。
自1976年以来,澳大利亚发生了4次高致病力禽流感,巴基斯坦和墨西哥等地也出现了高致病性禽流感的爆发[1]。
1996年,我国也从鹅体内分离到3株H5N1高致病性毒株。
禽流感的发生,尤其是高致病性禽流感的爆发,给世界经济带来了严重损失,给养殖业的发展带来了威胁。
禽流感,不仅威胁到养禽业,还直接威胁到人类的健康和生命安全。
1918-1919年西班牙流感(H1N1)的大爆发使全世界至少2100万人死亡;
1957年的亚洲流感(H2N2)和1968年的香港流感(H3N2)使亚洲患流感而死亡的人数达到数十万。
仅美国这两次的死亡人数就分别有7万人和3.4万人[2]。
经鉴定,引起上述的毒株与禽流感都有很高的同源性。
此后,H3N2在30年中,又发生了16次大流行,引起全球约1000万人死亡。
在1997年的香港禽流感事件中,禽流感更是突破种间障碍,直接感染人而引起人的死亡。
流感病毒的致病性主要取决于宿主与病毒之间的关系,病毒通过与宿主细胞膜上的受体蛋白特异性地结合,才能引起宿主细胞的感染[3]。
因此,受体是病毒入侵宿主细胞的门户,是介导病毒入侵的决定因素。
受体能通过与病毒的特异性结合决定病毒的细胞嗜性。
由于各物种间细胞受体可能存在差异,病毒跨种间传播会受到一定限制。
对于禽流感这样跨种间传播的疾病来说,研究其受体蛋白对了解病毒与宿主细胞的相互作用至关重要,能为研究流感病毒的遗传变异打下基础,并且可为揭示流感病毒如何选择物种及其跨越物种传播的分子机制提供证据,为防止新型流感的发生有着重要意义。
第二节AIV感染宿主细胞的分子机制
禽流感病毒之所以能引起宿主细胞的感染,与其核衣壳外囊膜上的两种穗状突起物有着密不可分的关系。
这两种物质就是HA和NA。
HA即血凝素,可使病毒吸附于易感细胞的表面受体上,诱导病毒囊膜和细胞膜的融合,是诱生保护性免疫的主要抗原;
NA即神经氨酸酶,可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸,当病毒在细胞表面成熟时,可除去细胞膜出芽点上的神经氨酸以利于病毒的释放[2]。
HA和NA都有免疫原性,能引起血凝作用。
禽流感病毒感染细胞的分子机制如下:
首先,HA蛋白识别宿主细胞的受体并与之结合;
接着,依赖宿主细胞转运蛋白水解酶切割,使HA2的N端融合序列裸露,与宿主细胞发生融合,病毒基因组进入宿主细胞,病毒开始复制[4]。
AIV侵入机体后,首先在呼吸道和消化道黏膜上皮细胞内繁殖,引起轻微的初期症状,如咳嗽、精神萎靡等。
当病毒在宿主体内增殖到一定数量时,可引起宿主的组织病变和其他症状[4]。
病毒随着血液循环、淋巴液循环进入宿主其他组织器官,引起全身各组织器官的变性、坏死,出现高热、呼吸困难等全身性症状。
未裂解的HA无传染性,只有在宿主呼吸道及肠道组织相应的蛋白酶作用下裂解为HA1和HA2,将融合肽暴露,才能与宿主细胞融合。
致病力强的AIV的HA1和HA2连接的多肽较长,且含多个额外的碱性氨基酸,这些氨基酸序列可能被多种蛋白酶所切割,因此使病毒的嗜细胞性增加。
一旦感染这样的病毒,病毒将会迅速突破器官屏障,快速引起全身性感染。
AIV极易发生变异。
AIV的基因分成8个不同的节段,混合感染病毒的不同株时,在病毒的基因复制过程中往往出现基因的重组,从而改变HA和NA的结构,形成新的AIV亚型[2]。
例如90年代,意大利在猪体内发现了禽与人流感重组病毒。
通过变异产生的新亚型,有可能改变病毒的致病力和易感宿主,使病毒出现跨越物种传播[1]。
如果人类同时感染禽流感病毒和人流感病毒,一旦两种病毒出现重组,将会是人类的一场未知的灾难。
流感病毒是通过HA与宿主细胞膜上的唾液酸受体蛋白相结合而引起宿主细胞的感染。
唾液酸的末端可以形成两种不同的α连接,连接两个碳原子和糖链,分别是唾液酸α-2,3-半乳糖的唾液寡糖和唾液酸α-2,6-半乳糖的唾液寡糖。
禽流感病毒的受体一般为唾液酸α-2,3-半乳糖的唾液寡糖;
人流感病毒的受体多为唾液酸α-2,6-半乳糖的唾液寡糖[5]。
理论上,禽流感病毒是不会感染人类的。
但当宿主细胞混合感染两种亚型的病毒时,通过病毒基因的重组或重排,使得原本只能与唾液酸α-2,3-半乳糖的唾液寡糖结合的禽流感病毒可能变异为有能力与唾液酸α-2,6-半乳糖的唾液寡糖结合的病毒,因而使得禽流感病毒对人具有感染性。
禽流感便实现了跨越物种间的传播。
因此,对于宿主细胞膜上AIV受体的研究将会为进一步研究AIV宿主的特异性转变打下分子基础。
第三节病毒受体及研究方法
1.3.1受体研究的意义
受体在宿主细胞与病毒的相互作用中有着极其重要的意义,其特性与病毒的细胞嗜性、宿主范围、有着密切关系,可决定病毒的致病性。
因此,病毒受体的研究一直是病毒学研究的热点。
随着科学的发展,研究手段的进步,有关病毒受体的研究已取得较大进展,许多病毒的受体结构和功能已取得不同程度的确认。
通过对病毒受体的研究,已经发现多种受体阻断剂来阻断病毒和受体的结合,从而让病毒病的防治有了新的方向。
流感是本世纪人类面临的最大的挑战之一。
其病毒的变异速度极快,给治疗带来了难题,若从如何消灭病毒的方向研究,将会是徒劳无功。
若能研究出流感病毒的受体拮抗物质,竞争地与病毒相结合,从而阻断病毒与宿主的结合,降低宿主感染病毒的机会,将会成为治疗流感的一个有效实用的途径。
1.3.2受体的种类
目前已发现的病毒受体可划分为糖蛋白、糖酯、蛋白聚糖和脂类等4种类型,其中大多数为糖蛋白[3]。
这些受体大致分为:
免疫球蛋白超家族成员(如HIV受体——CD4分子);
细胞因子受体(如牛痘病毒受体——表皮生长因子受体);
趋化因子(如HIV的共受体CCR5);
生理活性物质(RV受体——乙酰胆碱受体);
细胞表面受体家族成员(口蹄疫受体)等。
多数病毒在每个易感细胞上大约有1-10万个受体,大多数病毒受体分布于细胞表面,有的病毒需要细胞内受体进入细胞核进行复制、转录、包装成病毒粒子[3]。
1.3.3受体的研究方法
病毒受体研究的方法有经典的研究方法,也有现代分子生物学方法。
由于在细胞膜提取的过程中,细胞膜微囊的受损程度并不大,而细胞膜微囊在蛋白质、脂类组成和酶活性方面与活体细胞的细胞膜几乎是高度一致的,因此,分离纯化出的离体细胞膜在许多与病毒有关的实验中可以代替甚至优于活体细胞。
并且,细胞膜微囊不具有活体细胞膜所具备的吞噬作用和物质运输功能。
这就解决了用完整细胞做结合实验时结合作用和内吞作用不易区分的问题。
此外,使用没有细胞核和细胞质组分的细胞膜微囊,使病毒受体的分离也变得相对容易些。
最早用于蛋白受体研究的方法有免疫共沉淀等生物化学方法以及病毒覆盖蛋白结合法(VOPBA)等。
近年来,许多人开始使用酵母双杂交技术等以DNA重组克隆为基础的分子生物学方法。
目前,用于受体研究的方法技术有:
病毒蛋白铺覆技术;
单克隆抗体法;
免疫共沉淀;
cDNA文库;
亲和层析法;
噬菌体表面展示技术;
酵母双杂交技术等。
1.3.3.1病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)
VOPBA是较早用于病毒受体鉴定的方法,为鉴定病毒受体的经典方法[15]。
其操作步骤大致如下:
提取细胞膜蛋白—SDS-PAGE电泳—转印于硝酸纤维素膜上—与病毒液结合—洗去未结合病毒液—显色。
病毒与受体结合的显示方法有两种:
一种是利用同位素标记病毒粒子;
另一种是先用单克隆抗体或多抗与病毒结合,再用标记的二抗进行显色。
使用本方法的前提是:
受体活性是由单一多肽决定的,而不需要蛋白的辅助,且经过裂解液的处理不会丧失活性。
该方法操作简便,犬瘟热病毒、麻疹病毒、伪狂犬病毒、登革病毒、狂犬病毒、牛病毒性腹泻病病毒、新城疫病毒等病毒受体的研究均已通过该法获得成功。
VOPBA的缺点是只能了解受体分子量的大小,而不能了解受体的类型。
但对于已知受体的功能鉴定,该方法仍然是一种很好的选择,是比较常用的手段。
1.3.3.2酵母双杂交技术(Y2H)
Y2H是近年来随着分子生物学技术的发展,开发出来的一种更为简便有效的检测技术。
该技术的产生基于对酵母转录因子Gal4蛋白的认识。
目前,已建立的酵母双杂交系统有:
三杂交系统、单杂交系统、负选择系统、依赖于RNA聚合酶Ⅲ的酵母双杂交系统、哺乳动物双杂交系统、细胞质酵母双杂交系。
酵母具有生长迅速且易操作的特点。
与传统的方法相比,Y2H最突出的特点是可以在酵母的体系内部研究蛋白质之间的相互作用,避开了体外方法中实验条件对蛋白质研究的不利影响,灵敏度高,且无需体外纯化蛋白。
但通过该技术鉴定出的结果,容易出现假阳性和假阴性。
1.3.3.3其他受体鉴定技术
单克隆抗体法:
在针对病毒易感细胞的单克隆抗体中,能阻断病毒感染的单抗很可能通过与病毒受体结合达到阻断感染作用,针对这个单抗的膜蛋白就是受体。
通过这种方法鉴定的效率不高,并且具有一定的偶然性。
免疫共沉淀(Co-IP):
该法可以直接检测细胞提取物,蛋白质接近天然状态和构象,避免了人为因素,但有可能会有第三者蛋白参与沉淀。
因此,这种方法的敏感性较低。
cDNA文库:
是利用建立含受体基因的cDNA文库并转染非易感细胞,再经过筛选、克隆受体基因重建受体并予以鉴定,是一种既经典又在不断发展的方法。
亲和层析法:
是利用细胞膜上的受体蛋白与病毒的特异性结合来分离鉴定受体,灵敏性高,但存在载体价格高、机械强度低、配基制备困难等缺点。
噬菌体表面展示技术(PSDT):
其原理是将外源基因插入噬菌体衣壳蛋白基因中,使之与衣壳蛋白融合表达,随着噬菌体的成熟装配,融合蛋白展示于噬菌体表面并能保持较好的空间构型[6]。
此方法已被广泛用于配体-受体关系的研究中。
该法可以选择性筛选复杂的混合物,但插入的DNA片段只能是受体众多表位中的一个,因此要取得完整的受体基因,将耗费大量的工作。
蛋白质芯片(proteinchip):
是在后基因组时代为阐明基因组计划中测定的许多不明功能序列的基因的作用而发展的新技术,是一种用于蛋白质组水平研究的理想方法[6]。
与研究蛋白质的传统生化技术相比,其优点是高通量,微型化。
但由于蛋白质的空间结构复杂,其检测的灵敏度也大打折扣。
并且,蛋白质之间易相互作用,产生类似于抗原-抗体的特异结合作用。
另外,蛋白质容易变性的特点也为蛋白质芯片技术的开发带来了难题。
莹光共振能量转移(FRET):
利用绿色荧光蛋白及其突变体做为融合标记物来指示蛋白之间的相互作用[6]。
其应用广泛,是非常有价值和发展前途的研究手段之一。
FRET技术主要应用在细胞内蛋白激酶活性检测、膜蛋白定位修饰、膜受体激活效应、膜受体之间相互作用及细胞内分子之间相互作用等方面。
1.3.4AIV受体的鉴定方法
研究表明,AIV感染宿主细胞的前提是病毒与宿主细胞膜上的唾液酸受体蛋白相结合。
因此,选用常用的双抗显色的VOPBA方法即可对成纤维细胞膜上的禽流感受体蛋白进行初步鉴定。
第二章鸡胚成纤维细胞上禽流感病毒受体蛋白的鉴定
第一节实验材料
2.1.1材料
SPF鸡胚(9至11日龄)禽流感病毒A/Ty/WI/66株(保存于传染病教研室)
2.1.2器材
无菌手术器械;
超净台;
玻璃杯;
广口瓶;
吸管;
培养瓶;
照蛋器;
孵育箱;
CO2培养箱;
酶标仪;
KodakEDAS290凝胶成像分析系统;
电泳仪;
半干电转印仪等。
2.1.3试剂
碘酒;
酒精;
BSA;
DMEM培养液;
PBST;
优质胎牛血清;
碳酸氢钙;
胰酶;
Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒;
丽春红S(PonceauS)贮存液;
抗流感病毒一抗;
辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L);
DAB显示剂;
预染蛋白Marker;
PVDF膜等。
第二节实验方法
2.2.1病毒的增殖
2.2.1.1病毒接种
采用鸡胚尿囊腔接种。
具体操作如下:
①取9日龄鸡胚,用照蛋器照检。
画出气室边界和胎位,在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记,即为注射点。
标记时,尽量避开血管,以免引起鸡胚死亡;
也不要太靠近气室。
②以标记处为中心,用75%酒精沿中央向四周画圈消毒后,用开孔器在标记处开一小孔,约2mm即可。
③将冻存的禽流感病毒A/Ty/WI/66毒株取出,流水冲洗使其快速融化。
摇匀。
④用注射器吸取病毒液0.1~0.2ml。
针头以45°
斜插入鸡胚的孔中,至针头尾部接触蛋壳,注射完后缓缓抽出针头。
⑤用熔化的石蜡将小孔封闭,置于37℃孵箱培养。
2.2.1.2病毒回收
①将在孵育箱培养72h后的鸡胚取出,置于4℃冰箱内6h,使血管收缩,以便得到无胎血的纯尿囊液。
②用碘酒将气室消毒,酒精脱碘后,用灭菌剪刀轻轻敲开气室的蛋壳,夹掉。
换一把灭菌剪刀揭开壳膜和尿囊腔的绒毛膜。
③将鸡胚稍稍倾斜,用灭菌吸管将尿囊液轻轻吸出,置于离心管中。
④通过血凝实验测定出病毒的滴度后,分装于小离心管内,置于-80℃保存备用。
2.2.2CEF的培养
2.2.2.1取材
选用9日龄~11日龄的SPF鸡胚,消毒后放入超净台,将气室朝上,用灭菌后的镊子轻轻敲破蛋壳,沿气室边缘小心地夹掉蛋壳,换用新的无菌镊子揭掉尿囊腔绒毛膜,再用弯头镊子夹住鸡胚颈部将其取出,去头、四肢、内脏后放入玻璃杯中,用眼科剪将组织剪碎成1mm3左右的小碎块,用HBSS清洗至组织发白为止。
注意事项:
1.消毒鸡胚时,要分别用碘酒和酒精从鸡胚的中央向四周消毒。
2.夹掉蛋壳的时候注意不要让蛋壳碎屑落入蛋壳内。
3.本实验必须在超净台操作,所有器械必须严格灭菌。
2.2.2.2分离
分离CEF的方法主要采用酶消化法为主。
以胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法最常见。
胶原酶适用于消化纤维性组织、上皮组织及癌组织等;
胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织。
由于胶原酶在钙、镁离子和血清存在的条件下仍有活性,因此消化后需要清洗细胞。
再加上胶原酶的造价比较昂贵,会增加试验成本。
故胰蛋白酶消化法的使用相对来说更为常见。
具体操作方法如下:
①将组织碎块置于广口瓶中,加入适量浓度为2.5mg/ml的胰酶,于37℃水浴消化半小时左右(每5min震荡一次,使细胞消化得均匀)。
②30min后,组织将变得蓬松透明,此时,将消化液吸掉,丢弃。
用HBSS清洗两次,使消化终止。
2.2.2.3纯化
经过上述处理的细胞,可能混有上皮细胞,这就要求对分离得到的细胞进行纯化。
人工纯化的方法有:
酶消化法、机械划除法、反复贴壁法、克隆法、流式细胞仪分离法等。
通常在成纤维细胞的纯化中,联合使用酶消化法和反复贴壁法,利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同而将两者分开。
因此,在培养细胞的过程中,往往成纤维细胞会先脱壁,且传代后贴壁快、附着快;
上皮细胞在短时间内不能贴壁或附着不稳定,稍加振动即会浮起。
经上述处理2、3代后,就能够完全纯化成纤维细胞。
具体操作步骤如下:
①向培养瓶中加入适量2.5mg/mL胰蛋白酶,轻轻摇动瓶身,保证胰蛋白酶能够在所有细胞表面流过。
②吸出消化液,将培养瓶置于显微镜下观察。
如发现纤维样细胞变圆、脱壁,则立刻加入含血清的DMEM培养液使消化终止。
③用吹打法使培养瓶中的成纤维细胞分散均匀。
再将液体吸出,分装于培养瓶中,置于CO₂培养箱中培养。
2.2.2.4培养
选用加有血清的DMEM培养液对分离纯化的CEF进行培养。
血清的作用一是其中的生长因子可以促进CEF的有丝分裂,二是抑制上皮细胞的增殖。
培养液的PH值一般要求在7.2~7.4之间,PH值偏高或者偏低都会使细胞的生长受到影
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