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一般我们选择参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。
因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的参!
个人一些见解,供参考!
参的重要性,必要性:
要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是WesternBlot。
因为WesternBlot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
虽然,顺利的时候WesternBlot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。
所以,严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用。
特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人。
良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照;
另外还有参。
可是由于经费限制或者偷懒的原因,国的不少人做WesternBlot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
参是最容易被忽略的一项。
我们知道,要用WesternBlot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。
特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。
所以你需要参。
参即是部参照(InternalControl),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。
在WesternBlotting实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中,WesternBlotting实验结果须进行参校正已成为一种惯例。
但是,国仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了参的使用,将蛋白浓度测定作为规需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。
如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;
且敏感度低,要求蛋白的浓度较高。
比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry等几种方法。
BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。
但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。
另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差。
在Westernblotting实验时使用参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在WesternBlotting中使用参其实就是在WB过程中的另外用参对应的抗体检测参,这样在检测目的产物的同时可以检测参的表达,由于参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。
此外使用参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。
我想问一下,参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?
还是必须得跑两膜一个参一个目的蛋白啊?
洗膜的时候可以放在一起洗么?
如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么?
回答楼上的问题:
完全可以剪开分别加一抗孵育,我就是这么做的;
洗膜时最好分开洗涤,放在一起的话两膜可能重叠在一起,影响洗膜效果;
如果不剪膜,你两个一抗来源相同而且特异性很好(单抗)的话,可以一起孵育,不过应该注意可能存在的交叉反应,你可以尝试一下看看结果再定。
本人是新手,问一个很汗的问题,原核表达也需要做参么?
做参的蛋白在哪里找?
不甚感激
在WesternBlotting实验过程中使用参的方法有:
一、超级简便的标记参使用法:
只要在二抗孵育时加入HRP标记参抗体,按照正常操作即可。
二、普通参:
当目的蛋白的分子量大小与选用的参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。
然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使参蛋白与目的蛋白分开。
然后两块膜分别与参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。
常用的蛋白质参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。
我们实验室使用最多的是***工程与国外实验室合作开发的GAPDH,100μl一支,浓度为100μg/100μl,价格为988元人民币。
虽然公司网上称稀释比达1:
10000以上,至少可做100次Westernmini-blots,但我们一般按照1:
5000~6000稀释,不过效果确实非常好,荧光条带非常亮,而且抗体使用3~4次也没太大改变。
我们也使用过博奥森的beta-actin,200ul480元,稀释比1:
200~500。
因为稀释比不高,所以价格并不便宜。
更可气的是,我PC12细胞居然有两条条带,小鼠也是两条。
我也同意剪开,但是别忘记一个问题.
你要确保你剪开的部位没有蛋白.
kangchen的HRP-标记参很好
不需要剪膜更为直观,有说服力
我做了半年的western,就我对参的理解如下
1.所选参有一下:
GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.
2.做参可以:
一,检验你的整套western装置是否正常runeffectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.
3.选择参要根据你的目的蛋白的性质即你的目的蛋白是胞还是核,你蛋白的分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.
4.一般参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.
我想请问一下如果参和目的蛋白的差距很大,比如我的目的蛋白是一百多KD,可是常用的参都是30~50KD,是不是一定要分块胶来跑呢?
那么,我想请教一下用过β-actin做参的朋友,有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况?
当然前提是:
1,我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白,且检测到了我的目的条带。
2,用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现,在碧云天上,曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。
.beyotime./aa128.htm具体什么原因造成这种情况,我也不想太麻烦去搜了,还请知道的战友指教。
同时也算是给朋友们提个醒吧。
另,我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带,由于这个做的时间比较早了,不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因,不得而知。
仅供朋友们一个参考吧
有个弱弱的问题想请教一下:
β-actin与α-tubulin的主要区别是什么,在肌组织与上皮组织间表达是否相同?
请教一个问题:
目的蛋白的一抗和参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?
两个二抗是否也可以呢?
如果可以,需要注意什么问题?
!
会担心有影响。
保险一点,还是分别孵育。
你的目的蛋白和参分子量相差多少呢,如果相差比较大,你可以把2者剪开,分别孵育一抗。
如果分子量太相近了,还是先孵育目的蛋白一抗,重新封闭,再孵育参一抗。
GAPDH:
glyceraldehyde-3-phosphateDehydrogease(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶。
因为GAPDH作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。
在实验中,可能存在总蛋白浓度测定不准确;
或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差;
这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正,所以一般的western实验都需要进行参设置。
具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除,得到每个样品目的蛋白的相对含量。
然后才进行样品与样品之间的比较。
GAPDH检测。
WesternBlotting(检测条带大约在36kDa,稀释比例达10,000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。
图示:
抗GAPDH单抗(Cat#KC-5G4)检测心脏组织匀浆中的GAPDH水平。
A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。
抗GAPDH单抗稀释比例为1:
10,000,HRP羊抗鼠二抗(Cat#KC-MM-1302)稀释比例为1:
1000。
采用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrateKit试剂盒及X胶片曝光显影。
rockblues_baiwrote:
也是新手,不过个人为只要目的蛋白和参的分子量差距足够大当ECL显色时两条带就不会相互干扰,可以同时孵育,一抗二抗均可同时孵育。
因为我们用的都是特异性抗体,混合孵育从技术上是没问题的。
也有很多人在这样做,也有很好的结果。
从经济的角度考虑,剪膜、分开孵育,一抗4度过夜,这样一抗可以重复利用有时可重复2-3个月。
我觉得:
抗原表位有线性(氨基酸序列的不同)和构象型(空间结构的不同)两种,如果你的抗体识别的是构象型的表位,你做western时蛋白要变性,其构想结构破坏,导致抗体抗原不能识别结合,因而也会做不出结果;
如果是线性表位则天然的和蛋白变性后这种表位都存在,抗体抗原可以继续结合。
你要查询有关资料,排除一下是否是此原因所致。
wxq2005fw指教。
您说的很对,单克隆抗体的确可能存在这样的问题,但可能还不是主要原因。
查了一下actin(肌动蛋白):
“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型,α型分布于心肌和横纹肌细胞中,α及γ型分布于平滑肌细胞中,β及γ型分布于非肌细胞中。
”------baike.baidu./view/32327.htm
β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带,大概是这个原因吧。
xray兄,好久没有见到你啦!
不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。
就比如我上次买了个抗体,说明书上写着检测的smoothmuscleisoform的,因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型,所以就买了。
买来后一直不出条带,我纳闷了,于是提取大鼠主动脉组织作为对照,也不出条带。
火了,就用了另外个细胞株做对照,条带就出来了,而且很亮,压片时能见到荧光,但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次,大鼠主动脉组织也出过两次条带,但是非常细非常淡,若有若无那种,提高上样量也是这样,以致于根本不能扫描,
此公司做抗体是用的是一段合成肽,我比较了两种异构体,只有6,7个AA的差异,
我自己的解释是,这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform,但非常小的程度上也能检测到smoothmuscleisoform。
目前正在与此公司交涉。
xray19wrote:
不知道你前边有做过免疫组化没有,做免疫组化,其抗体识别的是未变性的抗原表位,如果能做出结果的话也能说名一定的问题把
哈哈,又见着palm兄了。
摊上老兄你这事,是得好好跟公司说道说道了
。
我也在怀疑是公司选用了不合适的抗原片段来制备β-actin抗体(或者,我选用了不合适的抗体
),以至于检测产生组织特异性。
因为,1,actin几种异构体的确存在组织分布特异性,β-actin分布于非肌细胞中作为骨架蛋白;
2,actin几种异构体的氨基酸序列具有较高的相似性(>
90%);
3,β-actin要作为参,得首先保证是组织广泛表达的(尤其是做蛋白的组织表达谱时)。
那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列
问题是我的抗体太久了,查不到是哪个公司的了
这两天有些忙,凑空我再查查公司β-actin抗体的相关信息吧。
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补充β-actin抗体的一些信息:
肌动蛋白(actin)是一种重要的骨架蛋白,目前在动物细胞中发现至少有6种亚型存在:
“Nonmusclebeta-andgamma-actin,alsoknownascytoplasmicactin,arepredominantlyexpressedinnonmusclecells,controlingcellstructureandmotility.alpha-cardiacandalpha-skeletalactinareexpressedinstriatedcardiacandskeletalmuscles,respectively;
twosmoothmuscleactins,alpha-andgamma-actin,arefoundprimarilyinvascularsmoothmuscleandentericsmoothmuscle,respectively.”
因此,理论上,特异性针对beta-actin的抗体必然在心肌和横纹肌中检测不到条带.但实际上,因为存在如下问题:
1,不同型actin之间具有较高的序列相似性(>
90%).
2,公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原.
因此,可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如,选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测Nonmuscle细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除Nonmuscle细胞外,还可以检测cardiac,skeletal,smoothmuscle细胞的actin.
实际上,公司所制备的beta-actin抗体确实存在上述情况.
1,选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗).这类的抗体占大多数,主要有santacruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(CatalogNo.:
3779),CellSignaling(#4967),AxxoraPLATFORM(BET-A300)等。
这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。
相关网址如下:
.cellsignal./products/4967.html
.scbt./datasheet-69879-beta-actin-ac-15-antibody.html
https:
//.sigmaaldrich./catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A1978
.prosci-inc./Antibody-TDS/3779%20B-actin.html
.axxora./actin-related_products-BET-A300-491/opfa.1.1.BET-A300-491.1916.4.1.html
2,选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。
主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).
相关网址如下:
.axxora./actin-related_products-PSC-3777/opfa.1.1.PSC-3777.1301.4.1.html
.epitomics./products/1784-1.php
.epitomics./products/1854-1.php
这类抗体便可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.
最为明显的区分可以见CellSignaling公司和EPITOMICS公司免疫组化的结果(顺请wxq2005fw指教):
参与一下
个人觉得,
1.参最好还是在目的蛋白膜上染
因为,测目的蛋白需要一个标准,那么蛋白测定是第一步,在我们电泳,上样的时候,又是关键的一步,总会有一些技术原因,你上的样量可能会不一致,所以,就需要对这膜,选择一个标准,我觉得简单的方法就是在同一膜上既染目的蛋白,又染参蛋白.如果,两种蛋白分子量相差很大,可以剪开来,单独染抗体;
如果相反,则可以先染目的蛋白,然后重新洗膜,封闭,染参蛋白.
2.关于把两种二抗不同的蛋白同时加一抗,我没有试过,因为担心抗体质量问题,再加上公司不同,抗体之间会有影响,但的确有人这样做,我觉得理论上可能会有犹豫,但实践中是可行的方法.
wxnacatawrote:
xray19朋友,你的问题我也同样遇到了,我做的是组织,提取的心肌组织的蛋白做的WB,现在发现正常大鼠的心肌组织beta-actin的条带非常浅,而病变模型的beta-actin条带很明显,开始觉得可能是自己蛋白测定或稀释的时候有问题(虽然自己觉得这种可能性很小),但是还是跑了此普通的蛋白电泳来验证自己的上样量,在普通蛋白电泳图上显示我的蛋白上样量是一致的。
那现在说明beta-actin确实在病变的组织中表达量发生变化了,既然这样为什么beta-actin还能作为一个看家基因呢?
是不是用GAPDH会好些?
如果beta-actin、GAPDH、tublin在某种病变的组织中均发生较大改变了(这种情况有可能,虽然几率很小),那该如何选择参呢?
请教各位在行的朋友,
actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。
actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括alpha-skeletalmuscleactin,alpha-cardiacmuscleactin,alpha-smoothmuscleactin,和gamma-smoothmuscleactin;
其余两种广泛分布于各种组织中,包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscleactin。
这些不同的亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。
因此不同的组织本来就应该选择不同的参,不能一概而论的。
你所谓的病变可能与心肌的重构有关,肌肉中的肌动蛋白很可能就发生了明显的变化。
beta-actin作为参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆,表达量非常丰富。
尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为参的有效性(好像是对于上样量>
20ug的蛋白区分能力下降,记不清楚了)但是发文章应该还是没有问题的。
至于其他的参也是可以考虑用的,GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,而tubulin和actin类似是细胞骨架的组成部分,但是不是肌肉的主要成分,应该是一个代替品。
三种同时发生变化的情况太少了,如果遇到的时候再具体分析,这个不好说,我认为如果是总蛋白的话可以用胞核的参如PCNA,TATA-boxbingdingprotein(TBP)甚至线粒体的参来代替,当然我认为这种可能性出现的几率比我买彩票奖差不多。
今晚回答这个问题对于我来说也是一个考验,很多基础知识都是通过网络和拚命的回忆来的,也算是对于actin这个参的一个全面了解了,希望有所帮助。
补充一点选参的原则:
所选的参与目的基因之间不能有调节关系,否则参就不客观了,如:
你是做与糖代相关的基因就不能选GAPDH,与细胞骨架相关的就不能选β-actin。
实验结果分析其实很简单:
如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的参量和目的蛋白量。
将各样品目的蛋白量分别除以其参含量,得到的数值即为参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。
如果样品量充分,可以先检测参,观测样品间参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行WesternBlotting实验,至参量一致为止;
若参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。
这样虽然麻烦一点,但是
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