Agilent1100高效液相色谱仪操作规程Word下载.docx
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成孔性能好,亲水性好,材料成本低。
可耐稀酸。
不适合于酮类、酯类、强酸、强碱类液体过滤。
聚酰胺类
尼龙6
(PA-6)
通用
具有亲水性,较耐碱不耐酸。
在酮、酚、醚及高分子醇类不被腐蚀。
聚砜类
聚砜(PS)
良好的化学和热稳定性,耐辐射,机械强度高。
聚偏氟乙烯/聚四氟乙烯膜
PDEF/PTFE
有机
PDEF耐化学腐蚀,耐氧化,耐高温,疏水性(酒精处理后变清水性),PTFE耐酸碱性强。
聚烯烃类
聚丙烯膜(PP)
具有良好的化学稳定性,耐酸碱和各种有机溶剂。
价格便宜,但孔径分布宽。
无机材料
陶瓷、玻璃BP、金属膜
耐高温,耐有机溶剂、耐生物降解等。
2.基本操作步骤:
(一)、开机:
1、打开计算机,进入中文WindowsXP画面,并运行CAGBootpServer程序(部分安装程序不需要运行Bootp)。
2、打开1200LC各模块电源。
3、待各模块自检完成后,双击“仪器1联机”图标,化学工作站自动与1200LC通讯,进入的工作站画面如下所示。
4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面,点击“视图”菜单中的“仪器实际值”,“在线光谱”,“化学工作站状态”,“系统视图”,“样品视图”,使其命令前有“√”标志,来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开冲洗阀。
7、点击“泵”图标,点击“设置泵…”选项,进入泵编辑画面。
8、设流速:
5ml/min,点击“确定”。
9、点击“泵”图标,点击“控制…”选项,选中“启动”,点击“确定”,则系统开始冲洗,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续冲洗,直到所有要用通道无气泡为止。
10、点击“泵”图标,点击“控制…”选项,选中“关闭”,点击“确定”关泵,关闭冲洗阀。
11、点击“泵”图标,点击“设置泵…选项”,设流速:
例如1.0ml/min。
12、点击泵下面的瓶图标,如下图所示(以单元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。
也可输入停泵的体积,点击“确定”。
13、点击“泵”图标,点击“泵辅助设定…”,设定“最流速梯度”,“最小冲程”,“压缩因子”,“主通道”。
(二)、数据采集方法编辑:
1、开始编辑完整方法:
●从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项,如下图所示选中除“数据分析”外的三项,点击“确定”,进入下一画面。
2、方法信息:
●在“方法注释”中加入方法的信息(如:
测试方法)。
●点击“确定”,进入下一画面。
3、泵参数设定:
(以四元泵为例)
●在“流速”处输入流量,如1ml/min,在“溶剂B”处输入80.0,(A=100-B-C-D),也可“插入”一行“时间表”,编辑梯度。
在“压力限”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。
●点击“确定”,进入下一画面。
4、自动进样器参数设定:
(以标准G1329A为例)
●选择合适的进样方式,如图所示,进样体积5.0ul,洗瓶位置为6号。
“标准进样”----只能输入进样体积,此方式无洗针功能。
“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。
“使用进样器程序”---可以点击“编辑”按钮进行进样程序编辑。
●“最优化”有“无”,“重叠进样周期”和“预取进样瓶”,可以根据实际情况选择。
●点击进“确定”,进入下一画面。
5、柱温箱参数设定:
●在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如:
40度。
并选中它,点击“更多>
>
”键,如图所示,选中“与左侧相同”,使柱温箱的温度左右一致。
6、检测器参数设定:
6.1、VWD检测器
●在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽(响应时间)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间,如>
0.1min(2s)。
●在“时间表”中可以“插入”一行,输入随时间切换的波长,如1min,波长=300nm。
点击“确定”,进入下一画面。
6.2、DWD检测器
7、在“运行时选项表”中选中“数据采集”,点击“确定”。
8、点击“方法”菜单,选中“方法另存为…”,输入一方法名,如“测试”,点击“确定”。
9、从菜单“视图”中选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变…”钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。
(如同时检测二个信号,则重复此操作,选中“信号窗口2”。
单击“改变”键,即可弹出右侧的“编辑信号图谱”窗口,进而选择所需的谱图信号。
10、点击“确定”,从“仪器”菜单选择“系统开启”。
(三)、序列的设置
1、从“序列”菜单中,打开“序列表…”,光标至于“行1”,单击“剪切”,去除“行1”,再单击“插入/批量输入向导”。
2、设置“操作”为“追加”,“开始位置”为“1”,“插入行数”为所需的样品数,如“3”,“方法名称”为“测试”,“样品名称”为“排毒清脂片”,“进样次数”为“3”,“样品类型”为“样品”或“标准物质”“质控物质”,点击“确定”:
3、光标至于“行3”、单击“追加一行”,设置冲洗仪器和色谱柱的样品和方法,“方法名称”选择已经设置好的“水醇洗柱”。
4、单击“确定”,完成序列设置。
5、从“序列”菜单中,打开“序列参数”选项,如下图所示,输入操作者名称,如“安装工程师”;
在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”,单击“确定”,完成设置。
6、从“序列”菜单中,打开“保存序列”选项,输入“文件名”,如“测试”,单击“确定”,完成设置。
7、等仪器准备好,基线平稳,从“运行控制”菜单中选择“运行序列”,进样(或者从操作界面上点击“开始”,进样)。
(若无自动进样
器,则基线平稳后,进样并搬动手动进样阀,启动运行。
)
(DAD,VWD色谱图如下所示:
(四)、数据分析方法编辑:
1、从“视图”菜单中,点击“数据分析”进入数据分析画面。
2、从“文件”菜单选择“调用信号”,选中您的数据文件名,如下图所示。
点击“确定”,则数据被调出。
3、做谱图优化:
从“图形”菜单中选择“信号选项”,如下图所示。
从“范围”中选择“满量程”或“自动量程”及合适的时间范围或选择“自定义量程”调整。
反复进行,直到图的比例合适为止。
点击“确定”。
4、积分:
●从“积分”菜单中选择“积分事件”选项,如下图所示。
选择合适的“斜率灵敏度”,“峰宽”,“最小峰面积”,“最小峰高”。
●从“积分”菜单中选择“积分”选项,则数据被积分。
●如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。
●点击左边“√”图标,将积分参数存入方法。
5、打印报告:
●从“报告”菜单中选择“设定报告”选项,进入如下图所示画面。
●点击“定量结果”框中“计算”右侧的黑三角,选中“面积百分比”,其它选项不变。
●点击“确定”。
●从“报告”菜单中选择“打印报告”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则点击“报告”底部的“打印”钮。
(四)、关机:
●关机前,先关灯,并必须用相应的溶剂充分冲洗系统。
●退出化学工作站,依提示关泵,及其它窗口,关闭计算机。
●关闭Agilent1200各模块电源开关。
(五)、Agilent1200LC维护保养:
1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如乙腈/甲醇适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)。
2、手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口。
3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。
4、带seal-wash的1200,要配制90%水+10%异丙醇,开启seal-wash清洗泵,溶剂不能干涸。
5、注意事项见说明书,或由现场工程师介绍。
(六)、维护知识问答
1、为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱:
由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器:
溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项?
HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。
在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。
缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.
清洗液配制:
90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力,不能干涸。
3、为什么Agilent1200LC的流动相管路非常细?
在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1~2个数量级。
因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效降低。
为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,Agilent1200LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。
毛细管线分类:
0.17mm内径------绿色;
0.12mm内径-------红色。
PEEK管线:
内径-----0.13mm;
0.18mm;
0.25mm;
0.5mm。
毛细管线优点:
柔韧性好.
***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。
4、流动相使用前为什么要脱气?
流动相使用前必须进行脱气处理,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。
气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。
溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。
若用FLD,可能会造成荧光猝灭。
常用的脱气方法比较:
氦气脱气法:
利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。
加热回流法:
效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法:
易抽走有机相。
超声脱气法:
流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此法效果最差。
在线真空脱气法:
Agilent1200LC真空脱机利用膜渗透技术,在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种方法,并适用于多元溶剂体系。
5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理?
溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器,从而影响泵的运行,尤其水溶液或磷酸盐缓冲液(PH=4—7)。
以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
A:
请严格执行溶剂过滤。
B:
请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液
C:
如果应用许可,可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.
D:
在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。
E:
避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下,尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
6、Agilent1200LC泵如何维护?
Agilent1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相,及时合理的维护非常重要。
流动相使用前请必须脱气、过滤。
使用缓冲盐时,要加在线Seal-wash选项。
关机前,用相应的溶剂充分冲洗系统。
D:
及时更换PurgeValve内的过滤芯。
(当打开PurgeValve时,压力高于10bar,表明过滤芯已堵)。
E:
使用合适的密封圈。
7、如何选择合适的泵头活塞密封圈?
泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用,但使用正相溶剂(如正己烷),不适合使用标准活塞密封圈,特别是长时间使用时,需更换另一种不同的密封圈,我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。
(p/n0905-14202/pk)
***注意:
聚四氟乙烯密封圈的压力范围为:
0—200bar;
建议在泵的压力限制中,将最大压力设为200bar。
8、使用梯度比例发时要注意那些事项?
当盐溶液与有机溶剂溶液混合时,盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶,而不会出现沉淀。
但是在比例阀的混合点,重力作用使盐颗粒沉淀下来,通常,阀A接水相/盐溶液,D接有机溶剂,此法连接可有效使盐回落到盐溶液中,并被溶解。
若颠倒过来,盐可能落在有机溶剂中,出现问题。
强烈建议:
当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时,推荐将缓冲盐通道接在A通道上,有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上;
定期用水冲洗所有的通道,以除去阀口上可能出现的盐沉淀。
9、更换色谱柱时要注意什么事项?
在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。
因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效降低。
为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent1200LC在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。
客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了,一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头,柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧接头,当完成第一次安张后,不锈钢卡套已固定死,当接不同的柱子时,要注意柱子接头处的形状和长度,否则会产生一个非常大的死体积。
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