转CryIA c 基因抗虫棉花棉籽的诱变活性研究Word文档格式.docx

转CryIA c 基因抗虫棉花棉籽的诱变活性研究Word文档格式.docx

《转CryIA c 基因抗虫棉花棉籽的诱变活性研究Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转CryIA c 基因抗虫棉花棉籽的诱变活性研究Word文档格式.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

我国研制的Bt棉的外源基因是经过人工改造的全序列合成基因[3]，故有必要评价Bt棉的棉籽产品对哺乳类、鱼类等非靶标生物的影响。

随着人们对化学物质遗传毒性的日益关注，出现了许多的遗传毒性检测方法，有的已经比较成熟。

比如小鼠骨髓嗜多染红细胞（Polychromaticerythrocytes,PCE）微核试验（micronucleustest,MNT）、精子畸形试验；

鱼类外周血红细胞微核试验等。

在过去二十年，微核试验作为一种简单、快速、灵敏的致突变物质的检测手段得到广泛的应用[4–6]。

在以往的鱼类微核试验中，大多选用本地的经济鱼类做试验材料[7–8]，迄今还没有用斑马鱼做微核试验的报道。

斑马鱼（Branchynaniorerio）是一种国际公认的急性毒性实验动物[9]，近年来又成为生物科学其它分支学科的实验动物[10]。

通过本实验也探索了斑马鱼作为微核试验材料的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

成年封闭群昆明种雄性小鼠，体重18~21g，由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供。

斑马鱼，自中国科学院发育生物研究所取当天产的鱼卵，孵化出仔鱼，饲养至可以摄食人工饲料时开始试验。

1.1.2实验材料

实验用Bt棉棉籽（Btcottonseed）、普通棉棉籽（CKcottonseed）及Bt棉棉籽油（Btcottonseedoil）、普通棉棉籽油（CKcottonseedoil）均由863Bt棉项目组提供。

棉籽粉中游离棉酚经中国国家饲料质量监督检验中心（北京）检测：

Bt棉棉籽粉中游离棉酚含量为1.7103mg/kg，普通棉棉籽粉中游离棉酚含量为2.2103mg/kg。

（一）小鼠饲料

棉籽粉按20%的比例与普通鼠全价颗粒饲料Ⅱ号饲料粉（购自北京实验动物研究中心）混合做成料块。

棉籽粉油以25ml/kg的比例加入饲料粉中，混匀做成料块。

（二）斑马鱼饲料

将棉籽粉掺入饲料（购自北京大学大北公司水产饲料厂），依据掺入饲料中的棉籽粉粉比例和种类构成各实验组之间的差异。

1.1.3试剂

环磷酰胺（Cyclophosphamide,CP）：

上海第十二制药厂出品，用重蒸水配成6mg/ml浓度的溶液。

氟化钠（NaF）：

北京化工厂出品，用硬骨鱼生理盐水配成0.6mg/ml浓度的溶液。

1.2方法

1.2.1实验分组与处理

1.2.1.1小鼠实验

（一）微核试验：

取健康成年昆明种雄性小鼠，随机分为四大组：

Btcottonseedpowder组（以下简称Btseed组）、CKcottonseedpowder组（以下简称CKseed组）、Btcottonseedoil组（以下简称Btoil组）、CKcottonseedoil组（以下简称CKoil组），每大组又分别设10d、20d、30d三个剂量组，同时设阴性对照组及阳性对照组。

每组6~8只小鼠。

阴性及阳性对照组均饲喂普通饲料，Btseed组饲喂Bt棉棉籽粉饲料，CKseed组饲喂普通棉棉籽粉饲料，Btoil组饲喂Bt棉棉籽油饲料，CKoil组饲喂普通棉棉籽油饲料。

阴性对照组于处死小鼠前48h、24h分别腹腔注射0.2ml生理盐水；

阳性对照组于处死小鼠前48h、24h分别腹腔注射CP，剂量为60mg/kg体重。

（二）精子畸形试验：

微核试验30天的实验组同时做精子畸形试验，并设阴性对照组及阳性对照组。

阴性对照组和阳性对照组于实验开始前两天分别腹腔注射生理盐水和CP两次，间隔24h，剂量同微核试验。

1.2.1.2斑马鱼实验

（一）棉籽粉对斑马鱼的急性毒性试验：

挑选发育一致的幼鱼（体重0.50.1g），随机分为四组，每组10条鱼：

阴性对照组、含8%Btcottonseedpowder组、含16%Btcottonseedpowder组、含32%Btcottonseedpowder组（见表1）。

以死亡率、行为形态观察、解剖观察作为急性毒性试验的指标。

试验时间15d。

（二）NaF诱导斑马鱼微核试验：

随机取50条鱼，腹腔注射NaF（30µ

g/g体重），在注射后0h、6h、12h、24h、32h点，取外周血制备血涂片标本，并取未注射NaF的10条鱼，制备血涂片作为阴性对照。

（三）棉籽粉诱导斑马鱼微核试验：

挑选发育一致的幼鱼（体重0.50.1g），随机分为十组，每组15条鱼：

阴性对照组、分别含2%、5%、10%、20%CKcottonseedpowder的四组、分别含2%、5%、10%、20%Btcottonseedpower的四组、阳性对照组（各组饲料成分配比参见表1，阳性对照组的饲料同阴性对照组）。

致突变试剂NaF于取材前24h经腹腔注射引入鱼体内。

试验时间60d。

（四）在各试验中，斑马鱼均饲养在养殖密度为1条鱼/升水、水温26±

1C、持续充气的环境下。

1.2.2小鼠微核试验方法

末次给药24h后拉断颈椎处死小鼠，取两侧股骨在生理盐水中破碎，沉淀片刻后取上清液离心，去上清后加1~2滴灭活小牛血清吹打混匀，血常规涂片。

无水甲醇固定5~10min，Giemsa染液（pH6.8）染色18min左右。

在油镜下观察计数。

PCE呈蓝灰色，正染红细胞（NormochromaticerythrocytesNCE）呈桔红色。

微核多呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，直径为细胞直径的1/20~1/5，嗜碱性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。

每只动物计数2000个PCE，至少来自两张片子，统计含有微核的PCE数，同时统计记数200个PCE时出现的NCE数目，计算PCE/NCE的比值。

对微核率进行t测验。

1.2.3小鼠精子畸形试验

拉断颈椎处死小鼠，剪开腹腔，取出双侧附睾，在生理盐水中剪碎，使精子游离出来。

用四层擦镜纸过滤，滤液收集于5ml尖底离心管中离心。

吸弃上清液，视沉淀多少留少许上清夜，指弹法打匀沉淀物，血常规涂片。

无水甲醇中固定5min，1%伊红水溶液染色30min，自来水冲洗。

用高倍镜或油镜按顺序检查精子形态。

每只动物检查完整精子1000个，至少来自两张片子。

畸形精子类型可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头、双尾等。

记录畸形精子总数，并分别记录各种类型畸形精子数。

计算畸形精子占观察精子总数的百分率。

对结果进行t测验。

1.2.5斑马鱼微核试验方法

解剖出心脏，在生理盐水中破碎组织，稍微放置沉淀后，取上清，离心，将沉淀混匀于少量灭活小牛血清中，血常规涂片，每条受试鱼制作一张血涂片标本。

无水甲醇固定15min，Giemsa染液（pH6.4）染色25min左右。

油镜下镜检，每张标本取两个计数点，每个计数点计数2000个红细胞，统计含有微核的红细胞数，一个红细胞中出现两个或多个微核，仍以一个微核细胞计数。

将斑马鱼红细胞和细胞核过长轴的截面近似看作椭圆，将微核截面近似看作圆，随机测量50个红细胞及其细胞核的长轴2a和短轴2b，并测量10个微核的直径2r。

依据椭圆的面积计算公式：

S=（πab）/4及圆的面积计算公式：

S=πr2，计算每个红细胞的核质面积比、微核与细胞质面积比。

表1斑马鱼急性毒性试验中各组饲料成分配比和游离棉酚含量（%）

Table1Theproportionofingredients&

freegossypolcontentinZebrafish’smealsforcontrolgroupandexperimentalgroupsinacutetoxicitytest（%）

试验分组

成分

酵母

添加剂

淀粉

CMC

面粉

Btseed

鱼粉

游离棉酚（%）

空白对照组

5

1

4

35

50

8%组

27

8

（0.013）

16%组

19

16

（0.027）

32%组

3

32

（0.054）

（注：

CMC为饲料粘和剂羧甲基醋酸纤维素钠；

淀粉有粘和作用；

添加剂主要提供维生素和矿物质）

2结果

2.1小鼠微核试验

由表2和图一看出，阴性对照组的微核率为2.3±

0.27‰，与本实验室以前的工作一致，与国内外的报道一致[11-12]，自发频率属正常范围。

阳性对照组的微核率为49.8±

1.75‰，与阴性对照组相比有极显著差异（P<

0.01），说明本实验条件是稳定可信的。

10d的Btseed组、CKoil组与阴性对照组比无显著差异（P>

0.05）；

CKseed组与阴性对照组比有显著性差异（P<

0.05），Btoil组与阴性对照组比有极显著性差异（P<

0.01），但这两组的微核率小于阴性对照组。

20d的Btseed组、Btoil组、CKoil组与阴性对照组比无显著性差异（P>

CKseed组与阴性对照组比有极显著性差异（P<

0.01），但其微核率比阴性对照组小。

30d的Btseed组与阴性对照组比有极显著性差异（P<

0.01），但其微核率小于阴性对照组；

其余各组与阴性对照相比无显著性差异（P>

0.05）。

饲喂棉籽粉或棉籽油饲料的各组与阳性对照组相比都有极显著差异（P<

0.01）。

相同剂量的Bt棉组和普通棉组进行比较，10d、30d的Btseed组与CKseed组之间、20d的Btoil组与CKoil组之间有显著性差异（P<

0.05），其中30d的Btseed组的微核率比30d的CKseed组小。

其余各组间无显著性差异（P>

从表2中看出，PCE/NCE均大于0.5，属正常范围[13]，即Bt棉棉籽粉及棉籽油对骨髓细胞无明显的抑制作用。

2.2小鼠精子畸形试验

结果如表3和图二所示，阴性对照组的精子畸变率为5.7±

1.11%，属正常范围。

阳性对照组的精子畸变率为16.2±

3.09%，与阴性对照组相比有极显著差异（P<

饲喂棉籽粉或棉籽油30d的各实验组与阴性对照组相比无显著性差异（P>

与阳性对照组相比差异显著（P<

相同剂量的Bt棉组和普通棉组进行比较，Btseed组与CKseed组间有显著性差异（P<

0.05），Btseed组的畸变率为6.0±

0.63%，小于CKseed组的畸变率7.8±

0.47%，都在正常范围内。

Btoil组与CKoil组相比无显著性差异（P>

表2棉籽粉及棉籽油对小鼠PCE微核率的影响

Table2Theeffectofcottonseedpowderandcottonseedoilonthemicronucleusfrequencyinmicebonemarrowpolychromaticerythrocytes

组号

组别

动物数量

微核率（‰）X±

S

P1

P2

P3

PCE/NCE

阴性对照

7

2.3±

0.27

1.00

2

阳性对照

49.8±

1.75

<

0.01

0.44

Btseed10d

2.5±

0.33

>

0.05

1.38

CKseed10d

1.0±

0.42

1.66

Btseed20d

2.4±

0.60

6

CKseed20d

1.86

Btseed30d

0.9±

0.30

1.20

CKseed30d

2.9±

1.26

9

Btoil10d

0.65

10

CKoil10d

1.7±

0.70

11

Btoil20d

3.0±

0.52

1.05

12

CKoil20d

1.5±

0.43

0.77

13

Btoil30d

2.3±

0.61

0.79

14

CKoil30d

1.8±

0.45

0.82

（P1与阴性对照比较P2与阳性对照比较P3相同剂量的Bt棉组和普通棉组进行比较）

表3棉籽粉及棉籽油对小鼠精子畸变率的影响

Table3Theeffectofcottonseedpowderandcottonseedoilonthespermmalformationrateofmice

观察精子总数

畸形精子类型

无钩香蕉形无定形胖头其它

畸形

精子数

精子畸变率X±

5500

69

95

94

21

314

5.7±

1.11

3500

89

44

238

151

45

567

16.2±

3.09

4000

41

65

49

58

28

241

6.0±

0.63

CKseed30d

36

43

140

272

7.8±

0.47

3000

85

61

229

7.6±

1.41

39

86

78

15

29

247

8.2±

1.33

（P1与阴性对照组比较p2与阳性对照组比较P3相同剂量的Bt棉组和普通棉组进行比较）

图一棉籽粉及棉籽油对小鼠PCE微核率的影响

Fig.1Theeffectofcottonseedpowderandcottonseedoilonthemicronucleusfrequencyin

micebonemarrowpolychromaticerythrocytes

图二棉籽粉及棉籽油对小鼠精子畸变率的影响

Fig.2Theeffectofcottonseedpowderandcottonseedoilonthespermmalformationrateofmice

2.3斑马鱼实验

2.3.1在急性毒性试验中，各组死亡率均为零；

各组试验鱼经其它指标检查，没有发现异常。

据此判断，Bt棉棉籽粉对斑马鱼无急性毒性。

2.3.2在NaF诱导斑马鱼外周血红细胞微核试验中，12h组、24h组、32h组的红细胞微核率与空白对照组相比，均表现了极明显的差异（见表4）。

斑马鱼外周血红细胞微核率表现出时间-效应关系（见图三）。

在棉籽粉诱导斑马鱼微核试验中，选用30μg/g体重的剂量，24h的受试时间作为阳性对照组的试验条件。

2.3.3由表5和图四看出，在棉籽粉诱导斑马鱼微核试验中，NaF诱导的阳性对照组的微核率与阴性对照组相比较，有极明显的差异（p<

0.01）。

长期摄食含有普通棉棉籽粉饲料的对照组或长期摄食含有Bt棉棉籽粉饲料的实验组，其微核率与阴性对照组的微核率比较，均无明显的差异（p>

0.05）；

而与NaF诱导的阳性对照组的微核率比较，均有极明显的差异（p<

长期摄食含有Bt棉棉籽粉饲料的各实验组的微核率，与长期摄食含有普通棉棉籽粉饲料的各对照组的微核率分别进行同剂量配对比较，均无明显的差异（p>

0.05）。

长期摄食含有Bt棉棉籽粉饲料，而由于掺入比例不同构成差异的各实验组的微核率通过方差分析进行相互比较，各组间无明显的差异（p>

2.3.4斑马鱼外周血红细胞及其细胞核和微核的截面积计算结果见表6。

表4腹腔注射NaF（30μg/g体重）诱导斑马鱼（Branchynaniorerio）外周血红细胞微核率（‰）

Table4MicronucleusfrequencyinducedbyNaF（30μg/gweight）inperipheralerythrocytesofZebrafish（Branchynaniorerio）

鱼数量

与空白对照组比较的差异

0h

0.25±

0.07

/

6h

0.30±

0.08

12h

0.85±

**

24h

1.20±

0.09

32h

0.90±

空白对照

（“/”：

无显著性差异，p>

0.05。

“**”：

有极显著性差异，P<

0.01）

图三腹腔注射NaF（30μg/g体重）诱发斑马鱼（Branchynaniorerio）外周血红细胞微核的时间—效应图