登革热实验室检测指南文档格式.docx
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3.疫点首发病例,必要时应采集第二份血标本,距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
(二)蚊媒标本采集
疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫,分类鉴定后,填写媒介标本采集信息表,按照采集地点分装,每管10-20只。
(三)标本保存、运送
标本应-70℃以下保存,血液标本可-20℃以下保存,但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输,避免冻融,样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容
(一)实验室检测
登革热疑似病例发生所在地医院和/或县(市)疾控机构采集病例血清,检测登革病毒抗原、核酸或抗体,检测流程参见图1。
(二)复核检测
1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本,抽样30%进行复核检测,疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测,暴发疫情复核检测不少于5例,疫情少于5例者应全部检测,病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例,重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测,阳性者分离病毒,从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因,完成序列分析。
3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例,应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。
(三)媒介标本检测
1.核酸检测
捕获的伊蚊成蚊或幼虫,进行核酸分型检测,并扩增病毒E蛋白编码基因,完成序列分析。
2.病毒分离
病毒核酸阳性的标本由国家、省或有条件的市级疾病预防控制机构进行病毒分离、基因组序列分析。
图1登革热疑似病例实验室检测流程
五、实验室检测方法
(一)临床标本检测
1、病原学检测
病原学检测主要适用于急性期血液标本。
(1)抗原检测:
一般发病后6天内血液标本NS1抗原检出率高。
标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染,适用于现场快速检测,可用于早期诊断(附件2,3)。
(2)核酸检测:
一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。
在病人血清中检出病毒核酸,可确诊而且能够分型,可用于早期诊断,但核酸检测容易因污染而产生假阳性,因此要求严格分区操作(附件4)。
(3)病毒分离:
一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。
将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养(附件5),出现病变以后,用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。
分离到登革病毒可以确诊,但其耗时长,不适于快速诊断。
2.血清学检测
血清学特异性抗体检测主要适用于发病5天以后血液样本,但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。
(1)血清特异性IgM抗体:
采用ELISA、免疫层析等方法检测。
IgM抗体阳性,提示患者可能新近感染登革病毒,适用于登革热早期诊断,但单份标本不能确诊(附件6)。
(2)血清特异性IgG抗体:
采用ELISA、免疫荧光(IFA)、免疫层析等方法检测。
患者恢复期血清IgG抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊(附件7,8)。
(3)中和抗体:
采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测,可用于分型。
患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
(二)媒介标本检测
1.标本处理
将分类后的伊蚊成蚊或幼虫,按照采集地点,每10~20只为一份进行研磨处理(附件9)。
2.病毒核酸检测
用RT-PCR的方法进行登革病毒核酸检测(见附件4)。
3.病毒分离
病毒核酸阳性的标本进行病毒分离(见附件5)。
六、实验室质量控制
(一)标本采集、保存和运送
采集的标本要做好标识,并记录标本的基本信息和流行病学信息,按本指南要求采集、保存和运送。
(二)实验室检测
1.根据发病时间,按本指南要求选择不同的检测方法。
2.核酸检测要防止各种污染,按操作规范设立相应对照。
3.应对检测试剂开展质控评价。
(三)各级疾病预防控制机构应定期开展督导检查、实验室技术人员培训与考核,及时发现问题。
七、结果的报告和反馈
疫点首发病例、重症病例和输入病例实验室检测结果24小时内反馈标本送检单位。
省级疾病防控机构应每年1月将上一年登革热实验室病原学(包括核酸检测、病毒分离、序列测定)监测结果,报国家疾病预防控制中心(见附表2),将结果发送至denguetest@。
八、生物安全
登革热实验室检测应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求,做好生物安全工作。
附件:
1.血液标本采集.血清分离.运送.保存标准化操作程序
2.酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
3.免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
4.RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序
5.细胞培养分离登革病毒
6.IgM捕捉ELISA法(MacELISA)检测登革热IgM抗体
7.酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
8.免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
9.蚊媒标本处理标准操作程序
附表:
1.疑似登革热病人检材送检一览表
2.病原学检测结果一览表
附件1
血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序
1目的
正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。
2范围
适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、分装、保存和运送。
3操作步骤
3.1采血
3.1.1用70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。
3.1.2然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤(1-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒),从穿刺点向外以1.5-2cm直径画圈进行消毒。
3.1.3用70%酒精脱碘。
3.1.4严格执行三步消毒后(注意对碘过敏的患者,只能用70%酒精消毒,消毒60秒钟),待穿刺部位酒精挥发干燥用无菌真空管,采集患者非抗凝血5mL。
3.2分离血清
3.2.1轻缓颠倒采血管数次,使血液与促凝剂混匀后静置,待血块完全凝固(放置时间过长会造成溶血,避免留置过夜)。
3.2.23000rpm离心,5分钟,然后用无菌吸管小心取上清转入3支冻存管,应避免吸取血细胞。
3.2.3标记。
用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号,顶端标记序列号,标记清楚后将血清放进标本盒,保存于2-8℃冰箱待初筛检测或运送保存。
在编码规则为“地区拼音首字母(JH)年份(2位)月(2位)-序列号(3位)”,如景洪市2013年8月份采集的第12份血标本的血清编号为JH1308-012,冻存管顶端分别标记012-1,012-2和012-3。
3.3运送保存。
3.3.1如果24小时能够完成初筛检测,并将标本运送至上级单位,运送前应将标本保存于2-8℃冰箱,运送时采用低温冷藏运输。
3.3.2如果不能及时运送,运送前应将标本保存于-20℃冰箱,运送时采用干冰或低温冷藏运输。
3.3.3样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置,保存于-70℃以下冰箱。
3.3.4所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。
4注意事项
4.1使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中,最后集中高压消毒,在任何情况下均不应试图将针头重新盖帽。
4.2采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中,以备集中高压灭菌,并立即用肥皂和水洗手。
4.3若发生针刺、皮肤破损或其它损伤,应立即用肥皂和水清洗伤口,不要立即止血。
4.4当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时,均应及时报告上级并按医疗救护规程进行评估和救护。
酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
酶联免疫法检测患者血清中登革病毒NS1抗原。
2适用范围
适用于患者血清或血浆中登革热病毒NS1抗原的快速检测。
3实验前准备
3.1核对被检样品(血清或血浆)患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2-8℃冰箱或冰上。
4检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒(酶联免疫法)(万泰公司)
6检测的环境条件
生物安全二级实验室(BSL-2)中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室(BSL-1)内进行。
7操作步骤
7.1将试剂盒在冰箱中取出,放置室温平衡30分钟,使用前将试剂轻轻震荡混匀。
7.2配液:
将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。
7.3编号:
将样品对应微孔板编号,每板设阴性对照3孔,阳性对照2孔和空白对照1孔。
7.4加稀释液:
每孔加稀释液50μL,空白孔除外。
7.5加样:
分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50μL,空白孔除外。
7.6温育:
用封板膜封板后,置37℃温育60分钟。
7.7每孔加酶标试剂50μL,空白孔除外,轻轻震荡混匀。
7.8温育:
用封板膜封板后,置37℃温育30分钟。
7.9洗板:
小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤5遍,最后一次尽量扣干。
7.10显色:
每孔加入显色剂A、B液各50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟。
7.11测定:
每孔加终止液50μL,10分钟内测定结果。
设定酶标仪波长于450nm处(建议使用双波长450nm/600-650nm检测),用空白孔调零后测定各孔A值。
8结果判定
8.1临界值计算:
临界值=0.10+阴性对照孔A值均值(阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算)。
8.2阴性对照的正常值范围:
阴性对照孔A≤0.1(若1孔A大于0.1应舍弃,若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1,应重复实验)。
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