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连接酶链式反应;
NASBA:
依赖性核酸序列的扩增;
PCR:
聚合酶链式反应;
RCA:
滚环扩增:
RT-PCR:
逆转录PCR;
SDA:
链替代扩增;
SNP:
单核苷酸多态性:
TMA:
转录依赖的扩增;
Invader:
侵染检测技术
1反应(PCR)
在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。
美国食品与与药品管理局(FDA)已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒(Roche),如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。
研究报道这些试剂盒的应用结果优于bDNA、NASBA扩增技术。
最近,PCR技术的最大突破就是对单管PCR产物进行实时荧光定量检测,该方法提高了灵敏度与特异性,并且易于操作。
如TaqMan就是采用这种技术,两端分标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后,其淬灭基团被具有5´
-3´
外切酶活性的TaqDNA聚合酶切掉,从而产生荧光,通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。
TaqMan技术另一种应用就是分子灯标(molecularbeacon)。
分子灯标为一茎环状结构的寡核苷酸探针,其环状区核苷酸序列与靶核酸互补,靠近两端的部分序列互补构成分子灯标的茎部,两末端分别标记荧光基团与淬灭基团。
没有靶核酸存在时,分子标保持茎环结构,荧光工团与淬灭基因距离较近,产生的荧光能量根据荧光共振能量转移原理转移到淬灭基团,并以热能的形式散发出去,从而检测不到或仅有微弱荧光本底。
当靶核酸存在时,茎部结构由于环状部分结合靶序列而被打开,荧光基团与淬灭基团分开,荧光产生。
此技术已经应用于结核及大肠肝菌O:
157的检测。
Amplifluor是分子灯标的另一种形式,以引物的形式用于PCR,其5´
端为茎环状结构并标记有荧光基团与淬灭基团,当Amplifluor被掺入到扩增产物中后,其茎环状结构被打开,产生荧光。
Jordens等人将其应用于HPV的分型检测。
同TaqMan中的分子灯标相比,Amplifluor技术不足之处是不能区分特异性与非特异性的PCR产物。
Scorpion为一修饰的Amplifluor,可以降低本底而优于TaqMan和分子灯。
三种形式的分子灯标在应用方面的不足之处就制备较困难,成本较高。
2连接酶链式反应(LCR)
在LCR中,一对寡核苷酸探针杂交到靶DNA的相邻序列上,之间形成的缺口被连接酶所连接,再由连接产物的引物进行温度循环扩增。
此方法的最大优点就是可用检测基因突变。
FDA已批准该类试剂盒用于检测沙眼衣原体,具有与PCR一致的检测灵敏度。
LCR最近也被应用于微阵列芯片。
靶核酸被杂交捕获后,等位基因特异性的探针被连接到一荧光标记的探针,等位基因特异的探针在5´
端有一段外加序列用来捕获DNA微阵列上的LCR产物,从而对带有荧光的产物进行测定。
这种技术结合了液相LCR的特异性与通用型阵列的多重性,进一步拓宽了LCR的应用。
3链替代扩增反应(SDA)
littleM等人结合SDA与实时荧光发了新一代DNA探针系统,即BDProbeTecET。
采用标记两种不同荧光基团的探针,在SDA过程中,该探针被掺入到双链扩增产物中,由限制内切酶的酶沏使淬灭基团与荧光基团分开,从而释放荧光。
此系统用于病原体的检测,最低可检测到10-15个脑膜炎双球菌或沙眼衣原体。
WestinL等人将SDA扩增技术应用于微电子芯片中,在一个电场中,生物素标记的引物被固定到微阵列上,另一电场中,靶核酸被杂交捕获,并在原位进行SDA反应,产物在电场作用下被定引物捕获。
尽管扩增与杂交捕获过程中有信号丧失,但还是可以达到一定的灵敏度(104拷贝)。
4依赖核酸序列的扩增(NASBA)
NASBA主要用来检测HIV的病毒载量,最近不同实验小组将其与其它检测方法比较得出了不同的结果,看来对该方法有待进一步的评价。
5转录介导的扩增(TMA)
TMA是一种利用RNA聚合酶和逆转录酶等温反应条件下来扩增RNA或DNA的系统。
主要产品为Gen-Probe,其检测沙眼衣原体与结核分枝杆菌的试剂盒已得到FDA批准上市。
最近研究表明,该方法用于HIV的定量检测,灵敏度高于RT-PCR和bDNA方法。
6枝链核酸信号放大系统(bDNA)
该系统是目前本实验室的在研课题,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。
在条件稳定的情况下,其检测灵敏度主要取决于信号的显示体系。
Chiron公司采用AP的发光底物1,2-二恶二酮(dioxetane),用发光检测仪来测量其发光强度,灵敏度大大提高。
尽管RT-PCR是唯一FDA批准用来定量分析血清HIV的技术,但bDNA方法在临床实验室也是经常利用的,并且最近的研究报道Bdna3.0在线性范围上(100-500000拷贝/毫升)优于RT-PCR。
BDNA技术应用的最大限制就是灵敏度不够高(与PCR相比)。
为了解决这个问题,Capaldi等人将DNA枝状体作为一个反应平台,结合到技状体上的寡核苷酸在DNA聚合酶作用下延伸和外切,产生大量的无机焦磷酸(ppi),在酶促作用下ppi可转变为ATP,ATP可通过荧光素酶酶促产生荧光信号来定量。
此方法灵敏度可达到5zmol(10-21mol),接近于PCR。
7杂交捕获
Digene公司建立起来的这种方法的原理是将DNA-RNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合,由标记AP的抗体介导产生化学发光信号。
被FDA批准的该类型试剂盒有淋球菌、沙眼衣原体和巨细胞病毒,并且是唯一被批准用来检测人类乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)的试剂盒。
8DNA裂解信号放大
在环状探针技术中(cyclingprobetechnology,CPT),探针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体,两端分别标记生物素与荧光蛋白,结合到靶核酸上后,RNA部分被RNA酶(H)降解,两端DNA部分脱落下来,同时靶核酸可继续用来结合探针。
反应后的体系在包被有链亲合素与蛋白G抗体的高流速硝酸纤维素膜上层析,如果没有靶核酸存在,完整的探针结合上胶体金-抗荧光蛋白接头,被包埋的链亲合素捕获后产生一条检测线,反之则没有。
最近该技术有用于耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌与耐万古霉素的肠道微球菌的检测。
侵染探针(Invader)技术为另一种DNA信号放大分析。
它是依据AFEN1酶的酶切特性来设计上、下游引物,上游引物的全部序列与下游引物(信号探针)的3´
部分序列可与靶核酸的一段连续序列杂交结合,这样下游引物的5´
端就如同在上游引物的侵入下而呈翼状探出,进而被FEN1酶切下,分析酶切片段可确定有无靶核酸的存在。
Hall等人使酶切下来大片段与按同样原理设计的分子灯标结合,后者经FEN1酶切后荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。
其检测灵敏度可达1000拷贝(靶核酸)以下。
该技术还可应用于单核苷酸多态性分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP),因为碱基错配可抑制FEN1的酶切。
用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致。
9滚环扩增(RCA)
RCA既可进行靶核酸扩增,也可进行信号放大扩增。
有线性与指数两种形式的RCA。
线性RCA是引物结合到环状DNA上后,在DNA聚合酶作用下被延伸。
产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状单链。
线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。
Schwetizetr等人建立了免疫RCA,引物的5´
端标记有抗体,抗原抗体反应后,加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA,然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交,最后对荧光信号进行检测,该方法的灵敏度可达0.1pg/ml。
指数RCA原理与线性RCA相同,采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物,该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸,其产物又作为第一种探针的模板,这样一来在很短的时间内(1h),产物呈指数递增。
Thomas等人证实其灵敏度可达到10拷贝,在1h内产物达107倍。
指数RCA可用于非环状DNA的扩增,设计一引物,其两端可结合到一段连续的序列上,并形成缺口,在连接酶作用下,引物被连接成环状。
此环状引物可作为RCA的模板,进行指数扩增。
此方法特异性很高,可用于突变与SNP的检测,若与荧光实时检测系统结合起来,其应用前景将是很广的。
10纳米颗粒(nanoparticles)
纳米材料是具有纳米介观尺度(0.1-100nm)的均匀的有机或无机分子。
按一定方法合成的均匀的胶体金颗粒在该领域一直是倍受青睐的,此纳米粒子在免疫标记领域已占有一席之地,并发挥着巨大的作用。
胶体金颗粒可与生物大分子表面的还原性的疏基结合。
人工合成的寡核苷酸探针经疏基修饰后就可被胶体金颗粒标记上,可用于固相核酸杂交的信号显示。
液相杂交中,通过胶体金标记的寡核苷酸探针与靶核酸的结合,使得胶体金颗粒聚集在一起而呈现颜色反应,根据颜色变化可判断靶核酸的存在与否。
直径介于纳米水平的胶体金颗粒和半导体材料都具有一定的光学、电子学和材料学特性,这些特性使得其在化学传感器、分光光度、量子斑点、缩微图象以及纳米结构构建等领域的应用非常广泛。
胶体金纳米颗粒用于核酸杂交检测也是本实验室在研课题之一,相信它将会同其它纳米材料一样在纳米科技领域发挥重要作用。
Southernblot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量,从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强,但存在费时费力的缺点。
另外,由于Southern法检测不经过靶片段的扩增(PCR),一般每个电泳通道需要10-30μg的DNA,在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱,不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组,造成限制性酶切位点丢失,Southern法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代转基因植物中检测外源基因拷贝数的应用。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如:
SYBRGREENI)或特异性的荧光探针(如:
Taqman探针),实时检测荧光量的变化,获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数:
CT值(CycleThreshold);
通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线,就可以准确定量样品的浓度。
荧光定量PCR技术具有简便、快捷的优点,能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA,对每克样品中20pg-10ng的转基因成分进行有效检测。
同时,与Southern法相比,荧光定量PCR技术可对T-DNA的不同序列进行扩增,因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测(Giovanna2002)。
流式细胞仪检测细胞凋亡
BIOX.CN
2005-4-1423:
55:
00
来源:
生命经纬
细胞凋亡的检测方法众多,流式细胞仪检测凋亡,是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此,具有其它方法无可比拟的优越性。
下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下,首先是细胞色素C和apaf-1形成复合体,线粒体的功能发生衰退;
后是caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,这时细胞的形态已经发生了改变,可以看到细胞变小,胞核皱缩;
最后是细胞内DNA断裂,形成凋亡小体。
(图1)
在凋亡发生的各个过程当中,都有相应的流式细胞仪的检测方法,可以采用以下检测方法:
1、线粒体功能
2、DNACycle
3、Caspases
4、AnnexinVAssay
5、DNAFragmentationAssays
(可以参阅
基本上涵盖了细胞凋亡的各个期,对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒(产品编号为BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是:
正常细胞中,染料可以在线粒体内聚集,发出明亮的红色荧光;
而细胞凋亡后,其线粒体膜电位发生改变,染料无法进入线粒体,只能在胞质中以单体形式存在,发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下,或流式检测。
采用488nm激发,其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单,只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多,也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒,只要有相应抗体基本上是可以检测的,具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变,细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin-V是一种35-36KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白,它对PS具有较高的亲和力。
细胞凋亡时,可以和外翻的PS结合,从而可以检测凋亡的细胞。
发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻,因而也会阳性。
因此,常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外,还会加一种DNA染料,常用的有PI和7-AAD,由于死亡的细胞膜通透性增高,染料可以进入细胞内和DNA结合,从而可以发荧光,区分出死细胞。
下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果,横坐标是Annexin-VFITC,纵坐标是PI,左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞,左下象限是存活的细胞,右下象限是凋亡的细胞。
在采用AnnixinV方法检测凋亡细胞时,要特别强调一点:
该方法适用于悬浮生长的细胞,如:
淋巴细胞等细胞的检测。
对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,从而影响检测结果。
尽管目前,包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。
我不推荐用该方法检测。
因为其重复性较差,且需要操作时非常小心。
(图2)
DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期,即细胞增殖状况的。
利用细胞内DNA能够和荧光染料,如PI结合的特性。
细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同,流式检测的荧光轻度也不一样。
G2-M期DNA含量是G0-G1的两倍,而S期介于两者之间。
但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少,因而可以在细胞G0-G1期前面有一个亚二倍体峰,从而认为是凋亡细胞。
但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的,因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。
在90年代,该方法曾经风靡一时,现在看来,那时的实验结果需要推敲。
尽管,经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0-G1期峰的一个峰,死亡的细胞峰离G0-G1期峰较远,但是这种典型的结果似乎很难获得。
有其它的替代方法,完全可以不用这种方法。
下图横轴代表PI的荧光强度,纵轴代表细胞数目,各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。
(图3)
晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂,因而可以出现DNAladder,从而也就有了经典的检测方法TUNEl。
流式也能进行Tunel检测,其检测原理与经典Tunel原理基本一致。
以BD公司的为例,其利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端,从而使凋亡的细胞具有荧光。
但是由于在细胞内标记,细胞需要进行固定处理,操作类似免疫组织化学法,容易造成假阳性。
建议采用原装大厂的试剂盒,并且严格的设立对照。
经过预实验方法稳定后再进行大规模实验。
标本处理后,均可以用荧光纤维镜进行观察,拍照。
流式检测后,可以进行精确的计算凋亡百分比。
这一点,经典TUNEl是做不到的。
(图4)
流式细胞仪的工作原理
2005-6-315:
14:
06
仪器分析网
(1)参数测量原理:
流式细胞计可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。
测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。
液流中央的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长相同。
散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。
未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。
经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变,其散射光信号当然不同于活细胞。
散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中,常用的是两种散射方向的散射光测量:
①前向角(即0。
角)散射(FSC);
②侧向散射(SSC),又称90。
角散射。
这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。
一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;
对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;
对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大,尤其需要注意。
侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。
侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中,仪器首先要对光散射信号进行测量。
当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。
光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分:
①自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;
②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。
自发荧光信号为噪声信号,在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。
在免疫细胞化学等测量中,对于结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键。
一般说来,细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强;
培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自发荧光越强;
细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是:
①尽量选用较亮的荧光染料;
②选用适宜的激光和滤片光学系统;
③采用电子补偿电路,将自发荧光的本底贡献予以补偿。
(2)样品分选原理:
流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。
总的过程是:
由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴,根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中;
其它液体被当作废液抽吸掉,某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。
稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。
一般液滴间距约距约数百μm。
实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。
其中v是液流速度,d为喷孔直径。
由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果。
使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。
充电电压一般选+150V,或-150V;
偏转板间的电位差为数千伏。
充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的,因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间,一般为数十ms。
精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。
可根据具体要求予以适当调整。
(3)数据处理原理:
FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析,至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。
①数据显示:
FCM的数据显示方式包括单参数直方图(histogram)、二维点图(dotplot)、二维等高图(contour)、假三维图(pseudo3D)和列表模式(listmode)等。
直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析,形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。
根据选择放大器类型不同,横座标可以是线性标度或对数标度,用“道数”(ChannelNo.)来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。
纵座标一般表示的是细胞的相对数。
二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。
横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数,平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在(图10-3)。
可以由二维点图得到两个一维直方图,但是由于兼并现象存在,二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。
所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点,这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。
二维等高图类似于地图上的等高线表示法。
它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。
等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数,即“等高”。
曲线层次越高所代表的细胞数愈多。
一般层次所表示的细胞数间隔是相等的,因此等高线越密集则表示变化率越大,等高线越疏则表示变化平衡。
假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。
它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现,但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作,以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ,这无疑是有助于对数据进行分析的。
②
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