分子生物学考场绝对压轴题Word文档下载推荐.docx
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筛选药物的靶点:
与组合化学和天然化合物分离技术结合,建立高通量的受体、酶结合试验以知识为基础的药物设计:
基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟—药物作用“口袋”。
个体化的药物治疗:
药物基因组学。
5)基础生物学:
基因功能的定位;
6)交叉学科的兴起。
如:
基因组学和生物信息学等。
3、什么是基因表达?
试述基因表达的特点及其调控对生物体的重要性?
1)基因表达︰从DNA到蛋白质的过程(是指原核生物和真核生物基因组中特定的结构基因所携带的遗传信息,经过转录、翻译等一系列过程,合成具有特定的生物学功能的各种蛋白质,表现出特定的生物学效应的全过程)但并非所有的基因表达都过程都产生蛋白质,rRNAtRNA编码基因转录产生RNA的过程也属于基因表达。
2)特点①组织特异性︰不同组织细胞中不仅表达的基因数量不同,而且基因表达的强度和种类也不相同。
②阶段特异性︰细胞分化发育的不同时期,基因表达的情况不相同。
③与环境相适应︰当周围的营养、温度、湿度、酸度及各条件变化时,生物体就要改变自身的基因表达状况,以调整体内执行和相应功能的蛋白质的种类、数量,从而改变自身的代谢活动度以来适应环境。
(3)对生物体的重要性︰1、适应环境、维持生长和繁殖。
2、维持个体发育和分化。
4、真核生物中,基因表达受不同水平的调控,请列举三种。
A.转录前调控︰基因丢失;
(原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物)转录前调控,非洲蛙蟾的卵母细胞中原有的rRNA基因约500bp,卵裂期和胚胎期需要大量的rRNA,基因会大量复制rRNA,使拷贝数达到200万倍,扩增约4000倍。
基因扩增(geneamplification);
基因重排(generearrangement)。
DNA的甲基化(DNAmethylation)组蛋白修饰(Histonemodification)/及组蛋白的修饰。
B.转录水平的调控︰转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的,调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。
C.转录后调控︰hnRNA的选择性加工运输;
mRNA前体的选择性剪接;
RNA编辑;
RNAi。
D.翻译调控︰翻译因子的磷酸化调控;
mRNA稳定性调控。
E.翻译后调控-蛋白质修饰。
5、为什么说转录的调控是基因表达调控的中心环节?
答︰基因调控主要发生在转录阶段,尤其起始阶段,因为这些是表达的起始阶段,可以避免那些不需要的转录所造成的资源浪费。
转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的,调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。
而且转录起始是基因表达的基本调控点,涉及DNA序列调控蛋白及这些因素对RNA聚合酶活性的影响,顺式作用元件和反式作用因子之间相互作用,均在转录起始来表达,而转录后的加工修饰为RNA以及翻译及翻译后的蛋白质修饰都是以转录水平为基础的。
6、举例说明DNA甲基化与肿瘤的关系
答︰DNA甲基化是基因表达修饰方式之一,与基因表达调控密切相关,它能关闭一些基因的活性,而去甲基化能诱导基因的重新活化及表达。
DNA甲基化修饰通过改变基因的表达,参与了细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。
DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA的稳定性、DNA与蛋白质相互作用方面的改变,从而控制基因表达。
加计划的状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。
这种变化包括︰
(1)整体甲基化水平降低;
(2)正常非甲基化CpG岛的高甲基化;
(3)维持甲基化模式酶的调节失控。
从而导致基因组的不稳定(如︰染色体的不稳定,可移动遗传因子的激活,原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。
列如︰对家族性和散发型乳腺癌和结肠癌的研究中发现,家族性肿瘤中序列无突变的10个抑癌基因启动子区域甲基化常见,但在突变的抑癌基因中没有发现甲基化的现象。
由此可见︰DNA甲基化模式的改变和肿瘤的发生、发展密切相关。
7、如何动物建模来评价促创伤愈合的新药作用效果?
8、对于新型促愈合药物可能的作用机制的研究思路?
9、试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件,及影响外源基因表达的因素。
外源基因表达所要具备的条件︰
(1)编码区不含插入序列(mRNA-cDNA);
(2)位于启动子下游,方向一致,原有的读码框不变;
(3)含起始密码子(AUG),终止密码(TAA);
(4)转录的必须有SD序列,调节SD序列与第一个AUG间的距离;
(5)选择系统编号的简并密码;
(6)增强产物的稳定(如︰融合蛋白,信号肽)。
影响因素︰
(1)启动子的强弱(主要因素);
(2)基因的剂量;
(3)RNA转录效率(SD互补,AUGSD距离及序列,AUG前后核苷酸序列的适宜性);
(4)密码子;
(5)表达产物的大小;
(6)产物的稳定性。
10、蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类,请例举其中一类,谈谈它的原理及应用。
答︰蛋白质的分离纯化可分为︰①依据溶解度差别,如硫酸铵分离法;
②依据分子大小不同︰透析、超过滤、离心法、凝胶过滤层析、凝胶电泳;
③依据蛋白质分子带点性质不同︰电泳、离子交换层析;
④依据蛋白质吸附性质不同︰吸附柱层析、吸附薄层层析;
⑤利用蛋白质的特异性配体︰亲和层析。
举例︰电泳。
其原理︰在一定PH值下,细胞表面带有净的正或负电荷,能在外加电场的作用下发生泳动,向正极或负极移动。
各种细胞或处于不同生理状态的同种蛋白质所带电荷的电量不同,故在一定的电场中的泳动速度也不同。
(影响颗粒电泳迁移率的因素︰缓冲液,电场,支持介质)类型︰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳、毛细管电泳。
应用︰电泳的类型很多,应用范围也很广,如︰SDS-PAGE,常用于蛋白质分子量的测定︰目前,双向凝胶电泳已成为蛋白质组学研究的重要技术。
11、以2GM—CSF为例,写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。
答:
1、GM—CSF全基因及可溶性sGM—CSF基因PCR扩增。
2、含肠激酶位点的pth10HisA·
sGM—CSF表达载体的构建(纯化后的GM—CSF,sGM—CSF及质检)。
3、诱导表达pth10HisA·
sGM—CSF在大肠杆菌BL21中诱导表达。
4、sGM—CSF融合蛋白的制备<
1度工程菌的培养2度超声破坏菌体。
5、sGM—CSF融合蛋白的纯化<
1度融合表达载体pthhisa在硫氧还蛋白融合段有组氨酸标签,用M2+固相化的chelatingsepharosefastflow填材料进行亲和,层析2度将可溶性表达产物(超声波,噬菌体的离心上清)与亲和柱结合,用2信柱床体积以上的A液过柱至基线平稳,用B液(A液加入朱唑至浓度为50mmol/L)梯度习脱5—10个柱体体积,用AKATAExplore进行检测,收集各洗脱液)。
6、sGM—CSF融合蛋白的肠激酶切割及纯化。
7、sGM—CSF融合蛋白及非融合蛋白的westernBlot检测。
12、干细胞应具备哪些生物学特点?
答:
干细胞是人体最原始的细胞,具有很强的再生能力,在干细胞因子和多种白细胞介素的联合作用下,可诱导分化出各种类型的细胞。
干细胞是自我更新能力,高度增殖和多向分化潜能的细胞。
A:
自我更新能力:
干细胞可不对称分裂为1个子代干细胞和1个功能细胞,从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡,但干细胞的分裂实际是不对称的,干细胞在其发育期间也能够对称性地分裂以扩增它们的数量。
B:
高度增殖能力:
因干细胞数量不多,所以其高度增殖的生物学特性有其重要意义:
体内:
如造血干细胞通过高度扩增,可补充由于细胞正常衰老死亡而丧失的血细胞。
体外:
体外扩增干细胞是干细胞研究和应用的前提和关键。
因此,高度扩增的生物学特征不但对干细胞的研究和应用有着重要作用,而且对机体正常功能的维持也起着重要作用。
C、多功能性或全能性一分化
干细胞具有分化为多种细胞类型的潜能,但不同干细胞的分化潜能有所不同。
胚胎干细胞:
全能性神经干细胞:
多功能性。
13、何为干细胞不对称分裂?
干细胞不对称分裂为1个子代干细胞和1个功能细胞,从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
例如:
皮肤更新,干细胞分裂后,其中一个成为干细胞,另一个则分化为上皮细胞或基底细胞等等。
14、什么是细胞分化?
为什么说细胞分化是基因选择性表达的结果?
(1)细胞分化(celldifferentiation):
指个体发育过程中,细胞后代之间在形态结构、生化组成和功能上向专一性和特异性方向发展,逐渐产生稳定性差异的过程。
(2)原因:
细胞分化的主要特征是新的、特异性蛋白质的合成,随后细胞在生化、结构、功能上发生变化,细胞表型出现差异,从分子层次上看,这是由于基因选择性表达的结果,即奢侈基因表达使细胞合成特异蛋白。
由于基因的选择性表达而合成分化细胞的某些特异性蛋白,执行特殊功能,因此细胞分化的本质就是基因表达调控的问题。
在细胞内与分化有关的基因按其功能分为两类:
一类是管家基因,表达的产物用以维持细胞自身的正常的新陈代谢;
另一类是奢侈基因,表达形成细胞功能的多样性。
细胞分化正是奢侈基因的选择性表达的结果。
因此细胞分化的实质就是基因的选择性表达的结果。
15、何为细胞全能性?
如何证明分化成熟细胞的全能性?
(1)细胞全能性(totipotency):
单个细胞在一定条件下可分化发育为完整个体的分化潜能称为全能性。
(2)证明分化成熟体细胞的全能性:
由于DNA的半保留复制和细胞的有丝分裂,从而使生物体的任何体细胞都具有了与原初的受精卵(有性生殖过程中)或起始细胞(无性生殖过程)相同的一整套基因。
依然受精卵或起始细胞可以发育成为一个新整体,那么受精卵或起始细胞复制而来的与受精卵或起始细胞具有相同的一整套基因的体细胞依然应该能发育成为一个完整的个体,即分化成熟的体细胞也是全能的。
体细胞的核移植到受精卵的胞质中时,这个具有新核的细胞可以发育为一个新的个体。
这说明分化成熟的体细胞核仍然保持完整的,在一定条件下的细胞全能性。
如克隆羊。
16、什么是表观遗传学?
它主要研究什么内容?
答︰
(1)基因的DNA序列不发上改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传的表型。
不依赖于DNA序列的遗传现象。
(2)①DNA甲基化修饰︰基因选择性转录表达的调控,主要表现为基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合,胞嘧啶由此被修饰为5-甲基胞嘧啶。
②非编码RNA的调控作用︰miRNA调节大约30%的人类基因表达。
miRNA可以通过靶向DNA或组蛋白修饰酶等表观遗传复合物而实现调节作用。
siRNA通过诱导染色质的形成来实现对基因表达的调控。
piRNA主要表现为在配子形成过程中对转座子元件的沉默作用,是生殖细胞发育所必须的。
③组蛋白修饰︰构成核小体的组蛋白,氨基端可以被多种酶进行各种修饰,如磷酸化,乙酰化,甲基化和泛素化,组蛋白的这类修饰可以改变DNA-组蛋白的相互作用,是染色质的构型发生改变,称为染色质构型重塑。
17、什么是甲基化,在调控基因表达过程中起什么作用?
(1)从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上催化其甲基转移到其他化合物的过程。
可形成各种甲基化合物,或者是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。
其中DNA甲基化是指在甲基化酶的作用下将一个甲基添加在DNA分子的碱基上,DNA甲基化修饰决定基因表达的模式,即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态。
(2)甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰,调节基因的表达和关闭,与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关,是表观遗传学的重要研究内容之一。
最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。
DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则又到了基因的重新活化和表达。
DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
研究证实,CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。
DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。
在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DMT)的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。
DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。
但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5ˊ-CpG-3ˊ的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
18、什么是基因印记?
它的主要特征是什么?
基因印迹,是表观遗传调节的一种形式,是指两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默,另一个亲本等位基因保持单等位基因活性。
2.特征;
a每一个印记基因簇由一个印记控制元件(imprintcontrolelement,ICE)所控制。
B也称为印记控制区域(imprintcontrolregion,ICR)或者印记中心(imprintcentre,IC)c绝大多数都有CpGislands,能够发生dna甲基化。
D在CpGislands,内或附近常有成簇的、有向的重复片段。
19、请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。
简洁答案:
肾上腺素能受体激活——与Gi偶联——AC活性下降——cAMP活性下降——平滑肌舒张。
胰高血糖素能受体——激活Gs、增加AC活性——cAMP——PKA(增加肝糖原分解)
叙述答案:
肾上腺素和胰高血糖素中的任何一种激素同肝细胞膜上相应受体结合后激化G蛋白,G蛋白化a亚基,a亚基激化腺苷酸环化酶(AC),AC催化小分子信使cAMP的产生,cAMP结合PKA,通过变构调节作用激化PKA,PKA通过磷酸化作用激化或抑制各种效应蛋白,继续传递信号,PKA激活磷酸化酶b激酶,促进糖原的分解代谢,糖原分解成1-磷酸葡萄糖,然后进一步分解为6-磷酸葡萄糖随后进入血液。
激活的PKA计入细胞核使cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化。
磷酸化的CREB结合于cAMP反应元件(CRE),并与CREB结合蛋白(CBP)结合。
与CREB结合后的CBP作用于通用转录因子(包括TFIIB),促进CFIIB等通用转录因子与启动子结合激活基因的表达。
20、细胞膜在信号转导的过程中起到怎样的作用?
答案1:
屏障作用,位于细胞膜的某些能特异性地与外源性物质结婚,并诱发细胞产生某些特定的生理生化反应,并最终产生生物学效应的物质。
答案2:
每个细胞在机体内并非孤立地存在,而是不断受到其生活环境中各种理化因素的影响。
各种信号,如化学、机械、电刺激信号,一般首先作用于细胞膜,膜上某些特异性蛋白质能选择性地接受某种特定信号,引起细胞膜两侧电位变化或细胞内发生某些功能改变;
细胞膜的这种作用称为跨膜信号转导功能。
细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激,经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能,这一过程称为细胞信号转导,这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式。
其中,水溶性信息分子如肽类激素、生长因子及某些脂溶性信息分子(如前列腺素)等,不能穿过细胞膜,需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信息分子,经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内,调节靶细胞功能,这一过程称为跨膜信号转导。
其过程包括:
①胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别,受体被活化;
②通过胞内信号转导物(蛋白激酶,第二信使等)的相互作用传递信号;
③信号导致效应物蛋白的活化,引发细胞应答(如激活核内转录因子,调节基因表达)。
脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜,与位于胞浆或核内的受体结合,激活的受体作为转录因子,改变靶基因的转录活性,从而诱发细胞特定的应答反应。
21、简述CRISPR/Cas-9的基本原理及优点(与传统的基于同源重组的胚胎干细胞基因敲除相比较)。
CRISPR/Cas-9此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNa复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双连DNA。
而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgDNA(shortguideRNA),足以引导Case9对DNA的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白,cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor),能够共定位RNA、DNA和蛋白,从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Case9(Cas9nuclease-null)融合,并表达适当的sgDNA,可靶定任何dsDNA序列,而sgDNA的末端可连接到目标DNA,不影响cas9的结合。
因此,cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA,这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
优点:
1、靶向精确性更高。
RNA靶向序列和基因组序必须完全匹配Cas9才会对DNA进行剪切。
2、可实现对靶基因多个位点同时敲出。
3、实验周期短,最快仅需2个月,节省大量时间和成本。
4、无物种限制。
22、为何在筛选靶基因敲除的胚胎干细胞时还需经历阴性筛选过程?
简述更昔洛韦(Ganciclovir)在胚胎干细胞阴性筛选中的作用机制。
P24,26题
23、基本概念siRNA&miRNA;
Dicerprotein;
RISC;
PTGS
siRNA:
是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。
SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。
miRNA:
是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。
成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
Dicerprotein:
一种核糖核酸内切酶,属于RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs),每个片段的3'
端都有2个碱基突出。
RISC:
RNA-inducedsilencingcomplex(RISC):
一种RNA-蛋白质复合物,通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。
SiRNA组装siRISC,miRNA组装miRISC。
RISCs(无论siRISC还是miRISC)包括两种类型:
切割型和不切割型。
现在的研究表明,RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。
PTGS:
转录后基因沉默:
在基因转录后的水平上通过对靶RNA进行特异性降解而使其失活。
24、请说明RNAi的作用机制。
dsRNA进入细胞内,被一种具有类似RNasetlI活性的核酸内切酶Dicer结合,并被酶切成19~23nt的小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),在ATP的作用下,siRNA与由多种蛋白质结合形成且具有活性的RNA沉默复合物(RNA—in—ducedsilencingco1TIpiex,RISC)结合,RISC具有解螺旋酶的功能,使与其结合的siRNA双链解螺旋成单链,释放正义链,保留反义链,随后识别并结合细胞内与其反义链相互补的mRNA链。
RISC将mRNA剪切成siRNA双链,降解mRMA,使靶基因表达沉默。
20XX年p11页7题。
25、请分析解释SUGuo的实验结果。
Su
Guo的实验证明了导入一个目的基因的正义与反义RNA可以达到敲除某个基因的效果。
因为该基因的野生型与突变型在胚芽时有对称与不对称的差异,所以她想从RNA共抑制现象(以前的研究结果)的基础上实现产生变异的效果,但是由于当时还没有研究清楚到底是哪种RNA起到了抑制的作用,所以她同时导入了正义与反义RNA,她当时的分析是反义的RNA可以特异性的与mRNA结合,从而阻止RNA的翻译以及以后的步骤,当然最后她成功了,用现在的科学成果进行分析和解释,由于她导入了正义与反义RNA,使得正义与反义RNA在细胞内特异性的互补形成了dsRNA,然后在被Dicer酶切割为干扰dsRNA,然后随着RISC形成并识别降解mRNA。
26、什么是细胞凋亡(Cellapoptosis)?
细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序死亡。
27、细胞凋亡有哪两条主要的途径?
细胞凋亡信号转导的两大途径
A:
由死亡受体(FAS、TNFR)介导的外源途径。
在这条途径中,启动capase-8首先被激活。
线粒体介导的内源途径。
在这条途径中,启动caspase—9首先被激活。
28、BCL—2家族的分类和结构特征?
Bcl-2家族成员分为两类
抗细胞凋亡,如Bcl-2、Bcl-xL、A1、Bcl-w、Mcl-1.在这类分子中,都有Bcl-2同源区1-4的结构。
促进细胞凋亡。
在这类分子中,又分为两个亚族:
_Bax亚族,如Bax、Bak。
Bok,有BH1、BH2和BH3的结构;
_BH-only亚族,如Bik,Bad,Bid、Bim,只有BH3的结构。
1988,Vaux等在依赖IL-3的B淋巴细胞中发现,转染Bcl-2基因能够阻止剥夺了IL-3的B细胞的凋亡。
因而,Bcl-2是第一个被发现的靠阻止细胞死亡而非促进细胞增殖起作用的癌基因。
Bcl-2抗凋亡作用的机制:
通过与促凋亡蛋白相互作用而抑制细胞凋亡。
Bax是细胞凋亡促进因子。
Bax自身可以组成同二聚体,也可以与Bcl-2构成异二聚体。
Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体与同二聚体的比值。
这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。
如果Bcl-2的过度表达,与BAx形成异二聚体中的Bax,使Bax游离而促进细胞凋亡。
Bad是细胞凋
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