HPLC测定蝙蝠蛾拟青霉培养物5种核苷类成分的含量Word下载.docx
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蝙蝠蛾拟青霉;
培养物;
核苷类成分;
含量测定
[收稿日期]2014-12-23
[基金项目]云南省教育厅科学研究基金重大专项(ZD2012009)
[通信作者]*马云淑,教授,硕士生导师,E-mail:
yunshuma2@
[作者简介]阳丹,硕士研究生,E-mail:
475802265@
Determinationof5nucleosidescomponentsincultureof
PaecilomyceshepialidbyHPLC
YANGDan,MAYun-shu*,HUANGTing-ting,CHENCheng
(YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,China)
[Abstract]Theconcentrationof5nucleosides,uracil,uridine,guanidine,adenineandadenosineincultureofPaecilomyceshepialidwasdeterminedbythedevelopedmethodofHPLC.TheHPLCmethodwasperformedonaWatersSunFireC18(4.6mm×
250mm,5μm)columnwithmethanol-watergradientelutionasthemobilephase.Thedetectionwavelengthwas260nmandthecolunmntemperaturewascontrolledat30℃.Thelinearrangewas10.00-200.00mg?
(r=0.9994)foruracil,10.10-202.00mg?
(r=0.9992)foruridine,10.00-200.00mg?
(r=0.9991)forguanidine,10.30-206.00mg?
(r=0.9992)foradenineand10.45-209.00mg?
(r=0.9991)foradenosine,respectively.TheRSDofprecisionwas0.032%,0.035%,0.039%,0.049%,0.00080%,respectively.Theaveragerecoveriesofuracil,guanidine,adenine,andadenosinewere97.34%,99.10%,101.6%,98.61%and100.2%withRSDof1.3%,2.1%,0.96%,0.95%,and1.3%respectively.Themethodshowedhighsensitivity,goodselectivity,linearityandrepeatability,whichwassuitableforthecontentanalysisof5nucleosidescomponentsinP.hepialidanditsextracts.
[Keywords]HPLC;
Paecilomyceshepialid;
culture;
nucleosidescomponents
doi:
10.4268/cjcmm20151521
蝙蝠蛾拟青霉菌Paecilomyceshepialichen&
amp;
dai丝体是采用现代高科技生物技术,利用新鲜冬虫夏草Cordyccpssincnsis从中分离所得的虫草菌――蝙蝠娥拟青霉菌株,隶属丛梗孢科Moniliaceae瓶梗青霉属P.bain真菌,通过人工深层发酵培养所得。
已作为冬虫夏草的代用品已在中成药和保健食品中广泛使用[1]。
据报道[2],冬虫夏草有效成分主要有尿苷、尿嘧啶、虫草素(3-脱氧腺苷)、腺嘌呤、鸟苷、腺苷等苷类化合物等。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的主要化学成分和药理作用基本相似[5]。
核苷类成分为虫草有效成分之一,具有扩张心脏和外周血管的药效作用,其中尤以腺苷的作用为显著。
目前对该菌发酵菌丝体的HPLC化学成分研究非常有限,仅限于腺苷和虫草素的报道[4-7]。
目前核苷类分析的常用方法有HPLC[8-10]、薄层色谱[11]、高效毛细管电泳[12-13]等。
本文首次采用HPLC同时测定5种核苷类成分:
尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤和腺苷,旨在对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的质量控制和对其提取物中的这5种核苷类成分进行含量测定及分析。
1材料
蝙蝠蛾拟青霉菌株P.hepialichen&
dai培养物(编号XGL001,包含固体培养基,培养方法为固体培养,以下简称:
蝙蝠蛾拟青霉培养物),蝙蝠蛾拟青霉菌株菌丝体(编号XGL001,不含培养基,培养方法为液体培养,以下简称:
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体),由云南云百草公司研究室培养提供,培养基:
由马铃薯等制成。
野生冬虫夏草:
由云南云百草公司研究室提供。
高效液相色谱仪(四元泵,美国Agilent1100Series,二极管阵列检测器)、KMDOS-SK250HP超声仪(上海科导超声仪器有限公司)、SartoriusBT25S电子分析1/10万天平(Xs25A瑞士普利赛斯仪器公司)、OSB-2100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)、TDL-5-A台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、酒精计。
尿嘧啶(中国食品药品检定研究院,批号100469-200401),尿苷(中国食品药品检定研究院,批号110887-200202),鸟苷(云百草公司提供,纯度99.61%),腺嘌呤(中国食品药品检定研究院,批号110886-201102),腺苷(中国食品药品检定研究院,批号110879-200202),娃哈哈纯净水,乙醇(市售食用级),甲醇(默克,批号1687507323,色谱纯级)。
2方法
2.1供试品的制备
2.1.1培养物原粉供试品精密称取0.1g蝙蝠蛾拟青霉培养物原粉,加入20%的甲醇提取液2mL,超声处理90min,取出,4000r?
min&
离心15min,用注射器吸取上清液,过0.45μm微孔滤膜,即得。
2.1.2菌丝体原粉供试品精密称取0.1g蝙蝠蛾拟青霉菌丝体原粉,同2.1.1项下法制得。
2.1.3野生冬虫夏草原粉供试品精密称取0.1g冬虫夏草原生药粉,同2.1.1项下制得。
2.1.4培养物醇提物供试品将蝙蝠蛾拟青霉培养物分别用90%乙醇10,8,6倍量热回流提取3次,每次1h,过滤,药渣备用。
收集乙醇提取液,减压回收至无醇味,于40℃干燥后得到醇提浸膏,出膏率为9.067%。
精密称取0.1g醇提物,同2.1.1项下制得。
2.1.5培养物水提物供试品将2.1.4项中醇提后的药渣挥至无醇味,再分别用10,8倍量的水热回流提取2次,每次1.5h,收集水提取液,80℃干燥得到水提物,出膏率为20.69%。
精密称取0.2g培养物水提物,同2.1.1项下制得。
2.1.6菌丝体醇提物供试品提取方法同培养物醇提物,得到醇提浸膏的出膏率为27.78%。
精密称取0.2g菌丝体醇提物,同2.1.1项下制得。
2.1.7菌丝体水提物供试品提取方法同培养物水提物,得到水提浸膏的出膏率为17.13%。
精密称取0.2g菌丝体水提物,同2.1.1项下制得。
2.2对照品的制备
精密称取尿嘧啶0.00200g,尿苷0.00201g,鸟苷0.00200g,腺嘌呤0.00206g,腺苷0.00209g,用20%甲醇定容至10mL,作为200mg?
混合对照品贮备液。
2.3方法与结果
2.3.1色谱条件WatersSunFireC18色谱柱(4.6mm×
250mm,5μm);
甲醇-水为流动相,HPLC色谱条件,见表1,检测波长260nm;
柱温30℃;
进样量10μL。
2.3.2系统适应性理论塔板数大于6000,分离度大于2,拖尾因子在0.95~1.05,对称性大于0.9。
3种样品溶液高效液相色谱图,见图1。
表1核苷类成分的HPLC色谱条件
图1蝙蝠蛾拟青霉培养物的HPLC图谱
Fig.1HPLCchromatogramsofPaecilomyceshepialichen&
dai
2.3.3标准曲线的绘制移取4mL200mg?
混合对照品贮备液于5mL量瓶,定容得160mg?
混合对照品溶液;
移取2.5mL200mg?
混合对照品溶液于5mL量瓶,定容得100μg?
mL&
移取2.5mL160μg?
混合对照品液于5mL量瓶,定容得80mg?
移取2.5mL80mg?
混合对照品液于5mL量瓶,定容得40mg?
移取2.5mL40mg?
混合对照品液于5mL量瓶,定容得20mg?
移取2.5mL20mg?
混合对照品液于5mL量瓶,定容得10mg?
混合对照品溶液。
将上述各混合对照品溶液过0.45μm微孔滤膜,即为供试样溶液,分别精密吸取各混合标准品供试溶液10.0μL注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定峰面积。
以峰面积为横坐标(X),对照品进样量为纵坐标(Y)求回归方程,见表2。
2.3.4精密度试验取100mg?
的混合对照品溶液连续进样6次,每次进样10μL,测量峰面积,RSD分别为0.032%,0.035%,0.039%,
表2核苷类回归方程
Table2Regressionequationsofnucleosidescomponents
名称t/min回归方程R2
尿嘧啶4.123Y=49.351X-127.310.9994
尿苷4.489Y=27.949X-87.0100.9992
鸟苷6.917Y=29.003X-95.2740.9991
腺嘌呤7.589Y=60.193X-190.720.9992
腺苷14.328Y=48.214X-163.850.9991
0.049%,0.00080%。
2.3.5稳定性试验取XGL001菌株培养物90%醇提部分按2.1.5项下制备供试品,分别于0,2,4,6,8,12,24h测定其稳定性。
结果RSD分别为2.9%,2.8%,2.0%,3.0%,1.1%,说明核苷类供试品液在24h内稳定性较好。
2.3.6重复性试验取XGL001菌株培养物90%醇提部分按2.1.5项下制备6份供试品,分别进样10μL,测定其含量。
RSD分别为1.3%,1.4%,1.5%,1.7%,2.1%,说明此法重复性好。
2.3.7加样回收率试验分别称取XGL001菌株培养物0.05007,0.05007,0.05002,0.10006,0.10004,0.10009,0.15015,0.15005,0.15008g置于9个5mL的离心管中,待用。
移取之前配制的1.2mL200mg?
混合对照品溶液于10mL量瓶中,用20%甲醇溶液定容至刻度线得到24mg?
的高浓度混合对照品溶液;
移取之前配制的1mL160mg?
混合对照品溶液于10mL量瓶中,用20%甲醇溶液定容至刻度线得到16mg?
的中浓度混合对照品溶液;
移取1mL80mg?
的混合对照品溶液于10mL量瓶中,用20%甲醇溶液定容至刻度线得到8mg?
的低浓度混合对照品溶液。
分别在之前加入低、中、高浓度3个样品的5mL离心管中相对应移入高、中、低浓度混合对照品溶液2mL,超声90min后称重补足质量,取出置于离心机中,于4000r?
条件下离心15min,取上清液用0.45μm滤头过滤取续滤液。
HPLC测定含量,结果为尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤和腺苷的平均加样回收率分别为97.34%,99.10%,101.6%,98.6%,100.2%,RSD分别为1.3%,2.1%,0.96%,0.95%,1.3%。
2.3.8蝙蝠蛾拟青霉培养物5种核苷类成分的测定根据2.3.1项下条件测定样品,见表3。
表3蝙蝠蛾拟青霉培养物及野生冬虫夏草的5种核苷类成分含量
Table35nucleosidesincultureofPaecilomyceshepialidandwildCordycepssinensisμg?
g&
样品尿嘧啶尿苷鸟苷腺嘌呤腺苷总量
培养物醇提物256.60697.30385.88141.59268.821750.19
水提物40.3570.3437.6625.2113.87187.43
原粉309.26728.33511.03189.83351.872090.32
菌丝体醇提物72.84238.0346.2717.0541.39415.58
水提物81.30100.32151.0428.4835.67396.81
原粉424.311257.301242.9677.19960.363962.12
野生冬虫夏草原粉77.721005.64470.3080.20367.562001.42
由上表3可知,蝙蝠蛾拟青霉培养物原粉的5种核苷类成分总量为2090.32μg?
;
培养物醇提物5种核苷类成分总量为1750.19μg?
,提取率为83.73%;
培养物水提物5种核苷类成分总量为187.43μg?
,相当于原粉中质量分数的8.97%;
菌丝体原粉5种核苷类成分总量为3962.12μg?
菌丝体醇提物5种核苷类成分总量为415.58μg?
,提取率为10.49%;
菌丝体水提物5种核苷类成分总量为396.81μg?
,相当于原粉的10.02%;
野生冬虫夏草原粉的核苷类成分总量为2001.42μg?
。
总体来看,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中5种核苷类成分含量最高,培养物次之,野生冬虫夏草5种核苷类成分含量与培养物相近。
4讨论
本文对流动相、波长和色谱柱条件进行了预实验选择:
①流动相的选择,通过文献查阅[4-10]及预实验对核苷类含量测定HPLC条件的摸索,发现甲醇-水为流动相时,色谱峰的分离度较好,故选定甲醇-水为流动相进行洗脱。
②波长的选择,取混合对照品溶液适量,于Agilent1100型高效液相色谱仪二极阵列管(DAD)检测器下260nm进行进样,每个对照品的紫外光谱图,5个对照品均在260nm附近有最大吸收,故最选定检测波长为260nm。
③色谱柱的选择,取混合对照品溶液适量,分别用WatersSunFireC18色谱柱(4.6mm×
250mm,5μm),ThermoBDSHYPERSILC18色谱柱(4.6mm×
250mm,5μm),DIKMADiamonsilC18
(2)色谱柱(4.6mm×
250mm,5μm)3种色谱柱分别进样,实验结果证明,ThermoBDSHYPERSILC18色谱柱和DIKMADiamonsilC18色谱柱的测定效果均不如WatersSunFireC18色谱柱,故选择WatersSunFireC18色谱柱来进行核苷类成分的含量测定。
该文所用的提取方法是前期正交试验结果所优选出的提取方法,能够较完全的提取出药物中的成分,并便于之后有效部位的萃取分离。
测定结果表明在菌丝体与培养物中5种核苷类含量均高于或接近冬虫夏草中含量,为二者作为冬虫夏草的替代品提供了依据。
而培养物中醇提物5个核苷含量提取率较高,而水提物提取率低;
菌丝体中则醇提物与水提物5个核苷含量提取率均较低,因此若以提取物制备制剂时需全面考察优先提取方法与工艺条件。
本文测定了蝙蝠蛾拟青霉菌株培养物及其有效部位中的尿嘧啶、尿苷、鸟苷、腺嘌呤和腺苷5种核苷类成分含量。
所选择谱柱后与梯度洗脱条件,能够较好分离并测量出样品中含量较高的5种核苷类成分。
本法具有操作简便、峰形好、重复性好、灵敏度高、数据重复性好、分离度好准确等特点,且流动相中无缓冲盐、有机溶剂少、酸性适宜等优点,可用于蝙蝠蛾拟青霉菌丝体质量的控制及其对各提取物中的核苷类成分含量测定及分析。
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[责任编辑丁广治]
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