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钙蛋白酶抑制蛋白基因(calpastatin,CAST)和抑肌素基因(myostatingene,MSTN)是肌肉生长的重要候选基因之一[13]。
与脂肪酸代谢有关酶类、结合蛋白基因是背膘厚和瘦肉率的重要候选基因,如激素敏感脂肪酶基因(hor2monesensitivelipase,HSL)、肥胖基因(obese,OB)等。
肌肉脂肪的种类和含量极大地影响猪肉的感官性状。
例如,日粮中共轭亚油酸(不饱和脂肪酸)含量不同会改变胴体品质,增加亚油酸(不饱和脂肪酸)会降低脂肪沉积,提高瘦肉率(ostrowskaetal.1999),然而,在日粮添加亚油酸(不饱和脂肪酸)能提高乙酰CoA,羧化酶,苹果酸酶,6-磷酸-葡萄糖-脱氢酶等几种脂肪合成酶的活性(Mourotetal.1994)。
最近,影响皮下脂肪组织亚油酸含量的的QTL作图于Iberian×
Landrace杂交猪的4号染色体上
脂肪酸的分类:
自然界的脂肪酸可以分为三类,,饱和脂肪酸(SaturatedFattyAcid.SFA),如软脂酸、硬脂酸等;
单不饱和脂(MonounsaturatedFattyAcid,MFA)),如油酸等;
多不饱和脂肪酸(PolyunsaturatedFattyAcid,PUFA),如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸(ARA)等。
动物体内能够合成饱和与单不饱和脂肪酸(称为非必需脂肪酸);
但不能合成维持机体正常生长和健康所需的一些脂肪酸(称为必需脂肪酸,EFA),如亚油酸和亚麻酸等,它们只能从食物中获得,其中亚油酸在甘油三酯和磷酸脂中占脂肪酸总量10%-20%。
脂肪酸的结构特点:
脂肪酸常用缩写符号表示,即第一个数字表示酞基链的碳原子数,紧跟着是一个冒号,以后的一个数字表示不饱和和双键数,然后是一个n-(或ω),其后的数字表示从酞基链的甲基端数起第一个双键的碳原子位置。
n-3脂肪酸的第一个双键位于甲基端第三个碳原子上,n-6脂肪酸的第一个双键位于甲基端的第六个碳原子上(图1),
饱和脂肪酸〔棕搁酸16:
0〕
单不饱和脂肪酸(油酸18,In-9)
n-3多不饱和脂肪酸(亚麻酸18:
3n-3)
n-6多不饱和脂肪酸〔亚油酸18:
2n-6〕
图1.饱和脂肪酸,n-9单不饱和以及n-6和n-3多不饱和脂肪酸结构示意图
Figure1Sketchmapofsaturated,n-9monounsaturated,n-6andn–3polyunsaturatedfattyacid
脂肪酸在生物体内的主要作用:
脂肪酸是生物体基本组成之一,具有重要的生理作用。
它们既是细胞膜脂的主要成分,又是重要的能源物质,还是一些信号分子的前体。
可与其它物质一起,分布于机体表面,防止机械损伤和热量散发等。
此外它还与细胞识别、种特异性和组织免疫等有密切关系。
多不饱和脂肪酸的消化吸收:
PUFA在动物体内消化吸收过程同其他脂类类似。
日粮脂类呈乳悬液状,以三酸甘油酷和磷脂形式进入十二指肠。
在肠内,脂-水临界面胆汁盐类使其吸附共脂酶(colipase),随之受到各种消化酶〔胰酶、脂酶、醋酶和磷脂酶〕的作用。
最后大多数以极低密度脂蛋白(VLDL)输送。
多不饱和脂肪酸的合成与转化:
哺乳类动物细胞可以由乙酰CoA从头合成饱和的以及n-9和n-7不饱和脂肪酸,其他的PUFA的生物合成是在饱和脂肪酸合成途径上扩展的,由两个主要反应组成,即碳链的延长和脱氢。
多不饱和脂肪酸的代谢:
脂肪酸β-氧化 (K.Knoop(1904)循环:
脂肪酸β-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径,脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量,脂肪酸β-氧化也是脂肪酸的改造过程,人体所需要的脂肪酸链的长短不同,通过β-氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸,供机体代谢所需。
每一轮脂肪酸β氧化都是由4步反应组成:
氧化、水化、再氧化和硫解。
E.P.Kennedy和A.L.Lehninger(1949)指出此氧化系统存在于线粒体中,后来D.E.Green及F.Lynen(1953)各自独立地从线粒体的丙酮粉末提取出可溶性酶,成功地分离出β氧化各个阶段的酶,明确了脂肪β氧化如图所示,按下述过程进行。
(1)由脂肪酸活化酶使脂肪酸与CoA结合,
(2)由乙酰CoA脱氢酶的作用使乙酰CoA脱氢,(3)由烯酰CoA水合酶的作用使烯酰CoA加水,(4)由β-羟基乙酰CoA脱氢酶的作用使β-羟基乙酰CoA脱氢,(5)由β-酮酰CoA硫解酶的作用使β酮酰CoA裂解。
经以上五个阶段逐次游离出来的乙酰CoA(C2片段)经三羧酸循环而氧化。
不饱和脂肪酸的氧化除需上述各种酶之外,还需要催化3-顺-烯酰CoA转变成2-反式的3-顺,2-反-烯酰CoA异构酶和催化D
(一)-3-羟式成L()-3-羟式的3-羟乙酰CoA-3-表异构酶参与。
由奇数C原子脂肪酸分解产生的丙酰coA,通过羧化及异构化而转变成琥珀酰CoA再进一步变化。
①不饱和脂肪酸的氧化。
不饱和脂肪酸也在线粒体中进行β-氧化,所不同的是饱和脂肪素β-氧化过程中产生的脂肪烯酰coa是反式△2脂烯酰coa,而天然不饱和脂肪酸中的双键均为顺式。
因此,需经线粒体特异的△3顺→△2反脂烯酰coa异构酶的催化,将△3顺式转变为β-氧化酶系所需的△2反式构型,然后沿β-氧化途径进行代谢。
②过氧化酶体脂肪酸氧化,除线粒体外,过氧化酶体中亦存在脂肪酸β-氧化酶系,它能使极长链脂肪酸氧化成较短链脂肪酸,而对较短链脂肪酸无效;
在脂肪酸氧化酶(fad为辅基)催化下,脱下的氢不与呼吸链偶联产生atp而是生成h2o2,后者为过氧化氢酶分解;
③丙酸的氧化,人体含有极少量奇数碳原子脂肪酸,β-氧化后除生成乙酰coa外,最终生成丙酰coa。
另外,支链氨基酸氧化亦可产生丙酰coa。
丙酰coa经β-羧化及异构酶的作用可转变为琥珀酰coa,然后参加三羧酸循环而被氧化。
饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都是通过β-氧化途径降解的,然而,不饱和脂肪酸在进入β-氧化作用循环前还存在双键,而与β-氧化直接有关的酶不可能处理所有的不同双链结构和天然化合物,故其代谢还需要额外的具有特殊功能的酶。
多不饱和脂肪酸进入β-氧化有两种途径来获得饱和(如图2):
一种是由参与β-氧化的酶和Δ3,Δ2-酰基-CoA异构酶来完成氧化;
另一种是NADP依赖的2,4-dienoyl-CoA脱氢酶(EC1.3.1.34)和Δ3,Δ2-酰基-CoA异构酶(EC5.3.3.8).结合作用而获得饱和,最终完成氧化。
靠β-氧化的脂肪酸代谢主要发生在线立体内,还有少部分在过氧化物酶体中进行。
大多数生物学来源的天然不饱和脂肪酸包括-cis双链和额外的双键,在三个碳原子间发生反应是非结合性的。
这样的分子结构对于β-氧化循环来说是有疑问的,在哺乳动物中三种辅酶必须有适合于氧化的稳定结构。
第一种辅酶是enoyl-CoA异构酶,其催化的产物能够进行下一步完整的β-氧化循环,接下来的初始步骤是产生一个2,4-dienoyl-CoA。
对于enoyl-CoA水合酶来说,这属于一个稀有底物,此时另外一种辅酶2,4-dienoyl-CoA还原酶(DECR)开始作用,DECR有显著的底物特异性,能够加工处理不论立体结构如何的所有偶数不饱和脂肪酸和大多数的奇数不饱和脂肪酸。
DECR在线立体和过氧化物酶体中有活性,线立体还原酶(mDECR)的存在确保CoA的含量不至于降低到所有细胞器氧化功能严重削弱的水平,而过氧化物酶体DECR对长链底物作用比mdecr更具有活性,当然,过氧化物酶β-氧化的功能是将长链脂肪酸改变为mDECR易于处理的形式。
在这三种辅酶中,DECR可能是限速酶,另外两种酶的Vmax从几百到1000μmol/min/mg不等,而mDECR的Vmax是30μmol/min/mg,因此,DECR可能是不饱和脂肪酸氧化的控制点。
对于人类生存来说,这与酶活性的重要性相一致,因为DECR的缺乏是致死性的。
已知有两种结构完全不同的DECR,两种酶都可以利用NADPH来催化2,4-dienoyl-CoA还原为enoyl-CoA,在细菌中发现有一种典型的埃希氏大肠杆菌单体酶,包括辅基FMN,FAD,和一个4Fe-4S群的三个主要结构域。
催化产生一个trans-2-enoyl-CoA直接进入β-氧化循环。
哺乳动物的DECR,其产生一个trans-3-enoyl-CoA。
接着第三个辅酶dienoyl-CoA异构酶催化trans-3-enoyl-CoA的衍生物形成更加稳定而且适合于β-氧化的结构trans-2-enoyl-CoA。
trans-2,cis/trans-4-dienoyl-CoA+NADPH+H+Trans-3-enoyl-CoA+NADP+。
哺乳动物和埃希氏大肠杆菌具有非常相似的底物特异性,但有不同的分子性质,牛肝脏和大肠杆菌的DECR的亚基的分子质量分别是32,000和73,000Da,天然酶蛋白的分子量分别为124,000和7,000Da,所以,哺乳动物的2,4-dienoyl-CoA还原是由四个同型亚基组成的四聚体,而大肠杆菌是一个单体酶。
真核生物DECR属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族成员,在已清楚的酶中有15%-30%相同序列的酶有3000多种,家族成员展示了一个调节不同生物学过程的特定底物的巨大扩展。
SDE家族成员的晶体结构已有7个基元图形描绘,这对于酶蛋白结构,辅助因子(NADH或NADHPH)的识别,结合,定位以及催化作用都是重要的。
人类mDECR含有5种与结构稳定和辅助因子结合的方面有关这类基元,但缺乏发生在催化部位的两种基元。
虽然与SDE家族其他成员相似,但与其他enoyl-thiolester还原酶是截然不同,因为它催化与众不同的共轭二烯增加物(anunusualadditionontoaconjugateddiene),而其他酶一般涉及脂肪酸的延伸,在延伸过程中增加一个2,3(或α,β)双键。
Fillgrove和Anderson运用一种精细的一流的生化核磁共振对大鼠肝脏mDECR的研究鉴别了还原的立体化学过程是新颖的并且在催化反应中一个赖氨酸是基本的。
在经典的SDRs中,这个赖氨酸在活性部位YXXXK基元与酪氨酸结合(X是任意氨基酸),而酰基还原酶的活性基元是YXXMXXK。
在mDECR的氨基酸序列中,离基本氨基酸赖氨酸N-末端最近的酪氨酸有大约14个氨基酸残基,一般情况下,一个丝氨酸直接和接触反应的酪氨酸结合,但对mDECR
的序列分析并不能揭示这个氨基酸为侯选氨基酸。
寻找结构信息去鉴别普遍存在的酪氨酸-丝氨酸对或确切地识别是否不同侯选型贡献DECR的功能。
人类DECR基因编码335个氨基酸多肽。
但很可能认为成熟的酶通过线立体的靶序列去除来截短的。
我们已描绘了缺乏N-末端34个残基的人类mDECR重组体的去除顶端的特性,它不仅有活性而且提供高度规则的晶体结构。
分子替换计算是不成功的,而这种相位首先从硒代甲硫酸氨的衍生物中获得。
后来,我们获得了一个三元复合物并结合定点突变和动力学分析测定残基对酶活性大小贡献大小。
现在,我们详细描述该酶的结构、辅助因子决定性和底物识别、关键残基的鉴定和他们对mDECR功能的贡献。
人类线立体DECR的晶体结构,包含有辅助因子的二元复合物分别位于2.1Å
和1.75Å
上的NADP和trans-2,trans-4-dienoyl-CoA。
一个同型四聚体是一个带有特定接触反应催化中心的短链脱氢酶/还原酶;
二元复合物与三元复合物在结构上高多相似,这表明此酶在与底物结合、加工过程中存在巨大的构象变化,催化位点是开放的且位于一个能够容纳和加工广范围的脂肪酸柔性环附近。
DECR的同型四聚体结构主要在肝脏、心脏、胰脏、和肾脏中表达。
此酶的缺乏可导致一个致死综合征,患者的症状主要表现为低纤维蛋白和高赖氨酸血症,尿液和血液中存在2-trans-4-cis-decadienoylcamitine,此代谢物的存在是亚油酸的不完全氧化所致。
DECR1基因的研究进展
DECR1基因编码2.4-dienoyl-CoA还原酶(EC1.3.1.34)。
该酶参与机体内多不饱和脂酰基CoA的ß
-氧化,对机体的新陈代谢有着重要的作用。
人的DECR基因位于8号染色体的91,082,756-91,133,403(EnsemblTranscriptID:
ENST00000220764),有10个外显子和9个内含子,总长度为30kb,转录长度为1,251bps,翻译产物335个氨基酸残基。
alignmentscore
黑猩猩的DECR基因位于8号染色体15,844,203-15,872,473(EnsemblTranscriptID:
ENSPTRT00000037769orENSPTRT00000037770),有5个外显子和4个内含子,转录长度为545bps,翻译产物147氨基酸残基。
小鼠的DECR基因位于4号染色体15,844,203-15,872,473(EnsemblTranscriptID:
ENSMUST00000029877),有10个外显子和9个内含子,转录长度为2,962bps,翻译产物335氨基酸残基。
负鼠的DECR基因位于scaffold_3的76,987,553-77,034,082(EnsemblTranscriptID:
ENSMODT00000009676orENSMODG00000007644),有9个外显子和8个内含子,转录长度为942bps,翻译产物313氨基酸残基。
牛的DECR基因位于14号染色体的45,837,768-45,860,253,有10个外显子和9个内含子,转录长度为963bps,翻译产物320哥氨基酸残基;
狗的DECR基因位于29号染色体的38,517,112-38,544,277(ENSCAFT00000014318),有9个外显子和8个内含子,转录长度为948bps,翻译产物为315氨基酸残基;
斑马鱼的DECR基因位于16号染色体的42,359,361-42,370,930(EnsemblTranscriptID:
ENSDART00000025292),有10个外显子核9个内含子,转录长度为1,487bps,翻译产物为氨基酸残基325;
猪的DECR1(2,4-dienoyl-CoAreductase1)基因位于4号染色体上,近来,一个对在皮下脂肪组织中亚油酸含量有极大影响的QTL被定位于Iberian×
Landrace杂种猪(2000).的4号染色体上。
Iberian猪的等位基因与亚油酸含量有1.5%的相关性并且此QTL表明在这两个商品猪种的表型有25%的差异。
此QTL与对脂肪沉积起主要作用的theFAT1QTL(A)染色体定位的一致性可提示在此区域的侯选基因(包脂质代谢)的特性。
猪的DECR基因位于4号染色体上靠近着丝粒的SW1003微卫星,微卫星S0001和SW839之间。
有趣的是,DECR基因在染色体上的位置与影响背膘中亚油酸含量的QTL可靠区域非常一致。
然而,DECR基因位于的theFATIQTL区间可能包含一个多效基因和几个脂质代谢和脂肪降解的主效基因。
PCR-SSCP分析技术
单核苷酸多态性标记(SingleNucleotidePolymorphism,SNPs)被称为“第三代DNA遗传标记”。
其是生物体基因组中存在的最广泛的一类变异,包括由碱基置换突变、单个碱基的缺失或插入等单碱基突变所造成的位点多态性。
SNPs的突变频率低,这样SNPs在构建完整的遗传图谱中成为一类十分有用的遗传标记。
例如,在人类的基因组中,对于一个杂合度为30%的SNPs,其发生的频率平均为1/1.3kb。
有许多不同的方法可用于SNPs分析,SSCP分析技术是其中的一种。
SSCP的建立与发展
日本Orita等研究发现,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体构象主要是有其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,有一个碱基发生变化时,会或多或少地影响其空间构象,是构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中受排阻大小不同。
因此称该方法为单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism,SSCP)分析。
刚建立时是首先将基因组DNA用限制性内切酶消化,碱变性成单链后经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,在经Southern转移到尼龙膜上,最后用标记探针杂交和放射自显影检测单链DNA片段的迁移。
在随后的研究中,Orita等又将SSCP用于检测PCR扩增产物的基因突变,从而建立了PCR-SSCP技术,进一步提高检测突变方法的简便性和灵敏性。
随着研究的深入改用银染法对电泳后的非变性聚丙烯酰胺凝胶染色,从而建立了非放射性检测方法。
为了进一步提高SSCP检测率,可将SSCP分析与其他突变检测方法相结合:
其中与杂交双链分析(Heterocluplexanalysis,Het)法结合可以大大提高检测率。
Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交,含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳被分离开。
PCR-SSCP方法的原理
经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下,经高温处理使之解链并保持在单链状态下,在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链可折叠成一定的空间构象,相同长度DNA单链因其碱基序列不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,单链DNA构象的变化很可能引起了迁移率的改变,通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差异,即多态性,这就说明检测到了突变。
PCR-SSCP能够检测出任何类型的突变,包括单碱基替换。
这种单碱基替换突变可以出现在几百个核苷酸长的目标序列中的任何位置。
PCR-SSCP的特点
1989年问世的PCR-SSCP作为检测基因突变的方法,经不断地改进和完善,更为简便、快捷、灵敏、不需要特殊的仪器,适合临床实验的需要,适于大样本筛选,因而具有一定的推广价值。
但它也有不足之处:
例如,他不能指出碱基突变的位置,只能作为一种突变检测的手段,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;
所检测的片段不能太大,否则检测率低;
电泳条件要求较严格;
由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时,再加上其他条件的影响,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
尽管如此,该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。
首先,他可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。
Hayashi经试验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变,99%可被SSCP发现,对于300-450bp片段的灵敏度为89%,因此,他认为现在知道的所有单碱基突变大多数可用该方法检测出来。
另外,PCR-SSCP不仅灵敏地检测出非编码序列中的突变,且能准确、有效地筛选出类保守座位中的突变,这位检测某个全长基因的多态性提供了有效的方法。
PCR-SSCP方法应用
PCR-SSCP技术建立以来,不断的发展、完善,再连锁分析和基因作图等领域取得了很大的成效。
同时被广泛应用于检测引起各种遗传病的基因突变,如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤Ⅰ型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。
此外,可检测肿瘤组织中的癌基因或抑癌基因的体细胞突变以及多态性,例如检测星型细胞瘤、肠癌等肿瘤中的p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等。
再者,其可用于病毒的分型、监测PCR试验中的污染情况,以及病原体传播途径的研究中。
近年来,PCR-SSCP技术应用于家畜DNA多态性研究的报道也日益增多。
单学松应用SSCP方法对奶牛weaver基因突变进行了检测,并探讨了影响SSCP检出率的因素。
Larsen等对PCR扩增的pGH基因614bp片段进行了SSCP分析,并报道了其研究成果。
方美英等应用PCR-SSCP分析发现了猪氟烷基因的多态性。
姜运良等对猪雌激素受体基因和猪肌肉生长抑制素基因进行了PCR-SSCP检测,在所检测的序列中均存在单链构象多态性。
Maddox用PCR-SSCP方法检测了绵羊DMB、DYA和DYB基因的第二外显子,分别发现了2、3和4个等位基因。
从以上可以看出,SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用。
目前,国内外还没有关于猪DECR基因的文献报道,作者意图用PCR-SSCP方法检测猪DECR基因。
本研究的目的与意义
目前,更多的研究集中于多不饱和脂肪酸的合成上,尤其是脂肪酸脱氢酶的结构和功能以及相关基因的研究。
但对于多不饱和脂肪酸在生物体内的分解代谢研究较少,
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