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ADSCs可从皮下脂肪组织中反复多次提取,有充足的来源,分离培养容易。
多项研究表明,ADSCs可向多种中胚层组织分化,并且具有较强的成脂分化能力。
ADSCs的旁分泌功能可促进脂肪组织的血管化,可提高移植组织的存活率。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有加速移植物血管化和促进细胞增殖的作用,是最有效的血管生成因子之一,作为一种广泛的生物活素,它可促进血管生成,使移植的脂肪血管化加速,增加了脂肪移植后的成活。
bFGF还有明显的促分裂和增殖的作用,对中胚层及外胚层的神经细胞有明显的促进增生的作用,增加未成熟的新生脂肪细胞的数量,使这些细胞增生成熟为大的脂肪细胞。
碱性成纤维细胞生长因子对促进自体脂肪移植方面的研究关注度较早,已有国外研究报道当bFGF与脂肪前体细胞共同注射到小鼠皮下脂肪时,可促进脂肪细胞生成;
通过临床对照研究发现碱性成纤维细胞生长因子可促进人体移植脂肪的存活,提升术后效果;
此外,也有部分文献通过动物实验研究,表明bFGF不仅能在自体脂肪移植中有促进深度烧伤创面修复与愈合的作用,亦能有效提高移植脂肪的重量,促进脂肪再生。
尽管众多的研究表明bFGF对移植脂肪的生存具有积极的效果,但国内外在这方面尚未给予一个统一的定论,在临床应用方面也不能广泛的应用。
并且单纯利用生长因子,存在代谢快、作用时间短、不能形成有效浓度等缺点,因此我们应用重组腺病毒携带bFGF基因(AD-bFGF),感染脂肪组织移植后起主导作用的脂肪干细胞,检测感染效率,检测bFGF的表达。
然后运用细胞疗法将重组腺病毒携带bFGF应用到颗粒脂肪移植的裸鼠动物模型中,探讨bFGF基因在增加脂肪移植成活率的作用,以期通过增加新生脂肪细胞数量,改善组织血运,提高颗粒脂肪移植的远期效果,为临床应用提供实验依据,开发运用脂肪移植巨大的潜能。
实际应用价值和学术意义
应用AD-bFGF感染脂肪干细胞,通过检测bFGF的表达,为AD-bFGF应用于脂肪移植的研究中提供了有力依据。
为组织工程脂肪的血管化研究提供一种有效的方法,为转基因脂肪组织工程的临床应用开辟了新思路。
通过探讨bFGF基因修饰的脂肪干细胞促进脂肪移植成活的可行性,改善和提高脂肪移植存活率,从而应用于外科脂肪移植手术中,减少并发症,提高颗粒脂肪移植的远期效果。
国内外研究现状
从自体脂肪移植用于乳房整形美容手术以来,外科医生不断地努力试图提高移植脂肪保持率,多数研究发现自体脂肪在移植后的长期稳定性欠佳,存活率可出现不同程度的降低,现有报道存活率大致为20%~80%[1];
目前认为影响自体脂肪存活率是多方面的,如自体脂肪采集部位、保存及处理方式、脂肪注射技术等,部分研究则认为移植脂肪存活率低的原因主要是新生血管不足以及由此产生不可预知的移植脂肪吸收[2];
因此,除了需要对脂肪移植的操作进行研究,对于改善和提高移植脂肪存活率的研究也尤为重要。
细胞疗法是指应用自体、异体或同种异体的细胞,经体外操作后回输(或植入)人体,以达到治疗、诊断或预防作用的目的。
细胞治疗在临床己有很多年的历史,输血、骨髓移植、造血干细胞移植等都属于细胞治疗的成功运用[3-4]。
近年来,随着人们对干细胞研究,特别是成体干细胞研究的不断深入,细胞疗法的治疗领域不断拓宽,延伸到了肿瘤的生物治疗、免疫治疗,糖尿病、冠心病的治疗等领域[5]。
利用细胞移植来促进移植物的再血管化,及时建立充足有效的微循环,保护缺血缺氧组织,促进血管生成和创面愈合,己经有很多动物实验的报道[6]。
脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs),又名脂肪间充质干细胞(adiposemesenchymalstemcells,AdMSCs)、成脂细胞(lipoblast)、前脂肪细胞(preadipocyte)或抽脂组织提取细胞(PLA),系指从脂肪组织中通过胶原酶消化后得到的一类贴壁细胞[7]。
ADSCs富含于人体体表脂肪组织中,来源充足,通过吸脂术采集安全且创伤小,加之其在成脂分化方面的突出优势,ADSCs在脂肪组织工程中被广泛关注[8]。
自体脂肪移植术由于游离脂肪组织不能及时生成滋养血管以提供养分,导致移植物缺血坏死和吸收,使得脂肪移植的临床应用受限。
在组织工程的研究中如何提高移植物的血管化能力也是一个难点。
多项研究表明,ADSCs具有促进组织血管形成的作用[9-11]。
ADSCs在低氧环境下能分泌多种与血管化相关的细胞因子,如血管上皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、HGF和胎盘生长因子等,这些血管化相关的细胞因子可促进血管生长[12]。
近年来研究显示,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有激活血管内皮细胞增殖和促进体内血管生成的作用[13]。
BANAI等研究显示,组织缺血后局部内源性bFGF表达增加,促进血管再生以适应缺血的变化,但此过程非常缓慢,而且bFGF增加的量不足以完全改善组织缺血状态[14]。
因此,在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF的量,将会加快血管新生的速度和增加血管新生的数量。
bFGF可以通过胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)作用与血管内皮细胞等靶细胞的bFGF受体上,激活c-fos,促进血管平滑肌和血管内皮细胞的增殖分化,促进肉芽组织中毛细血管网增生,加速创面愈合[15-16],同时它还能够刺激其他细胞因子的释放,如TGF、EGF、PDGF等,进而刺激血管内皮细胞的增殖分化,加速创面血管化,缩短创面愈合时间[17-18]。
目前对于移植脂肪的评价主要还是使用B超和CT,B超检测对局部脂肪的测量很有效,可以粗略测量脂肪团块的大小,并探查其内是否存在血流信号,炎性反应及钙化等,具有用时短,操作方便简易的优点,但准确性较CT低。
由于脂肪与周边其他成分有不重叠的灰度值范围,所以可以在CT上分割出脂肪的范围、面积,准确测量出脂肪的体积,从而计算出注射脂肪的吸收率。
利用CT技术检测注射脂肪后客观、准确,无创伤,在术后随访,判定疗效等方面具有独特优势[19]。
而应用形态学检测则可以进一步判断移植脂肪的成活情况,镜下可以观察到HE染色后脂肪组织周边脂肪细胞排列以及新生血管的形成。
免疫组化法对脂肪移植块内微血管进行定量研究的原理是利用内皮细胞特异性抗原通过酶标抗体,用组化法定位,直接显示血管壁。
内皮细胞CD34抗原在毛细血管、内皮细胞呈稳定强阳性,被认为是目前血管内皮细胞的最可靠标记。
CD34抗原免疫组化法显影后血管呈棕黄色,切片背景清晰,可以对微血管进行定性和定量研究。
微血管是指在切片上表现为由1-3个内皮细胞构成血管壁的血管。
把微血管作为血管计数的对象,统计出移植体平均血管密度,可以反映移植体的血液供应情况。
与CD34类似,VIII同样在新生血管中高表达阳性,是常用的对于血管生成的有效鉴定指标[20-22]。
自体颗粒脂肪移植因其来源丰富、为自身组织、无排斥反应,是理想的修复软组织缺损的方法。
但因移植后成活率低,一直限制了临床应用。
今年来已证实减少对脂肪细胞的损伤和促进血管生成药物均可提高移植脂肪成活率,但对于脂肪取材、清洗、离心、药物等因素如何提高移植脂肪成活率达到最理想的效果仍存在争议[23-24],需要进行更深入的研究。
促进脂肪移植血管化生长因子实验研究的成功将推动脂肪移植的发展,但很多的促血管生长因子研究仅限于实验阶段,如何使提高脂肪成活的药物在临床中得到广泛的应用,以及使用药物的最适浓度和最佳剂量的确定需进行更深入的研究[25]。
bFGF作为较强的促血管生成因子,其能否在脂肪移植的研究中同样发挥较强的促血管作用以促进脂肪移植成活,需进行实验研究。
随着促血管化因子的进一步研究,以及转基因技术在颗粒脂肪移植中的应用,将使自体颗粒脂肪移植成活率得到进一步提高。
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897一903
二、研究内容
研究目标、研究内容、创新之处和拟解决的关键问题
一、研究目标:
探讨以腺病毒载体介导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因修饰脂肪干细胞提高脂肪移植成活率的可行性。
二、研究内容:
1.利用消化分离方法和脂肪干细胞贴壁生长的特性,分离人脂肪干细胞。
脂肪组织经胶原酶消化,低速离心后去除成熟脂肪细胞、脂滴以及纤维结缔组织后,留下间充质血管细胞部分(stromal-vascularcellfraction,SVF)。
将SVF置于培养瓶中培养24h后移除红细胞,用含10%胎牛血清的基础培养基培养,贴壁生长的细胞即为ADSCs。
2.应用携带绿色荧光蛋白GFP基因的腺病毒载体(AD-GFP)感染脂肪干细胞,以GFP为报告基因,确定重组腺病毒对脂肪干细胞的感染效率。
构建过表达bFGF基因的腺病毒载体,观察腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子(AD-bFGF)对脂肪干细胞的感染效率以及感染后是否可形成有效的bFGF,确定感染强度(multiPlicityofinfection,Mol)值、目的蛋白表达及对细胞活性的影响。
3.观察AD-bFGF在颗粒脂肪移植中促血管化作用以及对脂肪成活的影响。
将人的颗粒脂肪加入AD-bFGF注射于裸鼠皮下,以观察其在脂肪移植中的作用,并设加入AD-GFP对照和加入生理盐水对照。
观察裸鼠进食、活动,及大体脂肪变化情况;
移植6周后,对移植物行B超及CT平扫检查,观察移植物是否出现炎性反应、钙化,结节等影像学改变。
实验动物在移植6周后处死,取出移植的脂肪组织,观察血供的建立,准确称重,比较脂肪移植体湿重并记录。
制作移植脂肪石蜡切片:
进行形态学检测:
行普通HE染色显微镜下观察是否有完整的脂肪细胞、脂肪细胞的大小及成熟程度、空泡和包囊的形成、炎症细胞浸润、纤维化或其他结缔组织。
行免疫组化染色:
移植体VIII、CD34染色微血管计数,反映移植体的血液供应情况。
统计学分析:
用SPSS13医学统计学软件对结果进行分析,结果以均数士标准差(x±
s)表示,两两之间比较采用LSD检验,以p<
0.05作为判断显著性的标准。
三、创新之处:
1.将腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子(AD-bFGF)应用到颗粒脂肪移植的研究中,国内外现无文献报道。
2.本实验运用组织工程技术,以脂肪来源干细胞作为种子细胞,使用bFGF基因修饰脂肪来源干细胞构建血管化组织工程脂肪的可行性。
3.除此之外,实验还对人脂肪来源干细胞移植复合物植入后各组标本的病理学形态等进行了观察研究。
实验结果以定性指标的例数作为统计数据,采样精细而准确。
实验为今后软组织填充材料的选择提供了一种理想方案和新的实验依据、理论支持。
四、拟解决的关键问题
移植脂肪成活的过程,即移植的脂肪颗粒植入受体后再血管化的过程,目前尚无有效的手段评估和控制,继而其坏死风险无法预计和评估,这成为脂肪移植应用中的一大限制。
如何加速移植脂肪的血管化进程,避免移植后的脂肪坏死,是有待解决的问题。
三、拟采取的研究方法、技术路线
拟采取的研究方法
第一部分利用消化分离方法和脂肪干细胞贴壁生长的特性,分离人脂肪干细胞,
脂肪组织经胶原酶消化,低速离心后去除成熟脂肪细胞、脂滴以及纤维结缔组织后,留下间充质血管细胞部分(stromal-vascularcellfraction,SVF)。
将SVF置于培养瓶中培养24h后移除红细胞,用含10%胎牛血清的基础培养基培养,贴壁生长的细胞
即为ADSCs。
第二部分bFGF基因过表达的腺病毒载体构建及转染
1.应用携带绿色荧光蛋白GFP基因的腺病毒载体(AD-GFP)感染脂肪干细胞,以GFP为报告基因,确定重组腺病毒对脂肪干细胞的感染效率。
2.构建过表达bFGF基因的腺病毒载体:
bFGF基因片段的制备和扩增;
重组腺病毒质粒克隆的制备;
腺病毒的包装、扩增及滴度测定。
3.体外构建AD-bFGF腺病毒载体,利用AdMax包装系统对其包装、纯化,鉴定重组病毒载体携带目的基因的正确性。
4.检测bFGF基因的表达情况。
第三部分bFGF基因修饰的脂肪细胞促进移植脂肪成活的初步研究
将人的颗粒脂肪加入AD-bFGF注射于裸鼠皮下,以观察其在脂肪移植中的作用,并设加入AD-GFP对照和加入生理盐水对
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