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目录
引言4
主要内容5
一、荧光光谱技术5
1.荧光发光机制5
2.常用荧光参数5
二、荧光光谱仪的原理及结构6
三、蛋白质的内源荧光与荧光探针7
1.蛋白质的内源荧光8
2.蛋白质的外源荧光8
四、荧光光谱法在蛋白质研究中的应用8
1.利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化8
2.利用荧光探针检测蛋白质的构象变化9
3.测定蛋白质的含量9
4.测定酶的活性9
5.研究小分子与蛋白质间的相互作用10
五、蛋白质荧光光谱研究的一些新方法10
1.同步荧光光谱10
2.三维荧光光谱法11
3.荧光共振能量传递分析12
结论13
参考文献(References):
14
引言
16世纪,西班牙科学家NicholasMonardes观察到,贮放在由菲律宾紫檀木制成的杯中的水会发出一种神奇而迷人的蓝光。
到17世纪,Boyle等其他科学家也观察并记载了类似的发光现象。
1864年,英国物理学家GeorgeStokes首先提出发光现象作为一种分析方法,他在1852年发表的关于发光现象的基础性论文以及随后的一系列研究工作,奠定了至今还在使用的许多发光概念的基础。
1978年,T.C.O’Haver在其论文里对发光现象及研究做了历史考证和评述(王镇浦等,1989)。
发光光谱法作为最古老的分析方法之一,目前仍然得到极为广泛的应用。
荧光光谱法是研究蛋白质的一种有效方法。
它能够提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点,已经成为一种重要的痕量分析技术,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。
同时,荧光光谱分析技术具有灵敏度高(比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级),选择性好,工作曲线线性范围宽等优点。
所以,该方法在蛋白质研究中得到越来越广泛的应用。
主要内容
一、荧光光谱技术
某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。
荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。
1.荧光发光机制
每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。
当物质被光照射后,大约在10-15s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。
处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧光。
因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。
由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。
图1荧光产生机理
2.常用荧光参数
荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。
因而被广泛地应用于各个研究领域。
它能提供包括激发谱、发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能的关系。
1)激发光谱和发射光谱
荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。
激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况;
发射谱则是在某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况。
在发射谱中最大荧光强度对应的荧光波长称为最大荧光波长,记为λmax,它是荧光光谱的一个重要参数,对环境的极性和荧光团的运动很敏感。
为了有利于测定,一般都选择激发光谱的峰位测定发射光谱,选择发射光谱的峰位测定激发光谱[1]。
激发光谱与发射光谱呈镜象对称关系。
2)荧光强度
荧光强度是最常用的参数,与很多因素有关,可用下列公式表示:
F=KφΙ0(1-c-εbc)
式中:
F是荧光强度;
K是仪器常数;
φ是量子产率;
Ι0是激发强度;
ε是摩尔吸收系数;
b是荧光池的光径;
c是荧光物质溶液的浓度。
当溶液很稀时,上式可简化为
F=KΙ0φεbc=KΙ0φA
式中A为光吸收值,A=εbc。
可知,在低浓度下,样品浓度和荧光强度呈线性关系。
利用此公式,可用荧光光谱法测定荧光物质,如氨基酸、蛋白质含量。
3)量子产率
量子产率表示荧光物质发射荧光的本领,用φ表示。
其定义为发射的光量子数与吸收的光量子数之比,又称荧光效率或量子效率。
若两种溶液测量条件完全相同,则可用相对法测定φ:
φ1/φ2=F1A2/F2A1,F是荧光强度,A为光吸收值。
量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。
因此,如果要研究量子产率的相对值,只要测量荧光强度也就足够。
二、荧光光谱仪的原理及结构
能发射荧光的物质称为荧光物质。
测定荧光光谱的仪器称荧光光谱仪,其结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。
其工作原理是由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出荧光,荧光经过滤和反射后,被光电倍增管接受,然后以图或数字的形式显示出来。
图2是FluoroMax22荧光光谱仪示意图。
仪器主要由光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测器以及显示系统组成。
荧光光谱仪常用光源有钨灯、氢灯、氘灯、汞灯、激光灯等,紫外光源用得最多。
氙灯在200~800nm范围内具较好的发射光谱。
汞灯是校准用光源。
单色器用来选择特定波长的单色光入射到样品上。
检测器一般用光电管或光电倍增管,将光信号放大并转为电信号。
荧光光谱仪的样品池是四面透光的石英杯,且用去荧光石英材料制成,它可以作为紫外分光光度计的样品池。
测量液体时,光源与检测器成直角安排。
紫外分光光度计的样品池是两面透光的样池,它不能作为荧光光谱仪的样品池。
发射光单色器或称第二单色器放在样品池和检测器之间,其作用是让被测样品所发生的荧光透过,而滤去由激发光所发生的反射光、闪射光,也就是用来选择一定波长的光进入检测器测量。
计算机辅助记录系统用以完成绘图及荧光强度的测量。
UV-VIS光源
单色器
样品池
透射光
显示器
计算机
检测器
发射光单色器
荧光
图2荧光光谱仪示意图
三、蛋白质的内源荧光与荧光探针
利用荧光光谱法研究蛋白质一般有两种方法。
一是测定蛋白质分子的自身荧光(内源荧光),另一种是当蛋白质本身不能发射荧光时,通过非共价吸附或共价作用向蛋白质分子的特殊部位引入外源荧光(也称荧光探针),然后测定外源荧光物质的荧光。
1.蛋白质的内源荧光
含有芳香族氨基酸(色氨酸(tryptophan,Trp)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe))残基的蛋白质在280nm或295nm的激发光的激发下会产生荧光,这种荧光称为内源性荧光(天然荧光)。
Trp、Tyr和Phe由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光光谱。
其荧光峰位波长分别是348、303、282nm,其中Trp的荧光强度最大,而Phe的荧光强度则很低,因此蛋白质的内源荧光主要是由Trp和Tyr残基形成的。
同时在含有Trp和Tyr的蛋白质中,由于其分子发生了从Tyr残基到Trp残基的能量转移,从而导致Tyr残基的荧光猝灭和Trp残基的荧光增加,因而Trp最常被用作内源探针来研究蛋白质的结构。
2.蛋白质的外源荧光
所谓外源荧光光谱法就是利用小分子荧光化合物与其荧光较弱或不发荧光的物质共价或非共价结合,形成发强荧光的络合物,然后测定络合物的荧光。
常用测定蛋白质的荧光探针主要有丹磺酰氯、荧光胺、12苯胺基萘282磺酸(12anilinonaphthalene282sulfonate,ANS)、22对甲苯胺基萘262磺酸(22p2toluidinonathalene262sulfonate,TNS)、12(N2二甲基胺)2萘252磺酸(12(N2dimethylamino)2naphthalene252sulfonate,DNS)等。
四、荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
1.利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化
利用蛋白质中的芳香族氨基酸残基的侧链基团具有吸收紫外区域的入射光从而发射荧光的特性,来研究蛋白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。
其基本机理是:
荧光来源于生色团基团在不同电子能级之间的跃迁,荧光频率取决于能级之间的能量差,生色团基团与周围基团的相互作用可能会改变其处于激发态时所具有的能量,从而改变其发射荧光的频率与强度。
同一种荧光分子在不同极性的环境中,其最大吸收波长可能会有所差别。
一般来说,极性环境会影响生色团基团的基态和激发态能级,减少激发态的能量,从而引起发射谱的红移(使λmax增大)。
在天然的蛋白质中,可产生荧光的芳香族氨基酸分子多处于蛋白质的内部,被多种非极性氨基酸残基包围,因此其所处的局部小环境的极性弱于蛋白质分子外部水溶液的极性。
蛋白质变性过程中,芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露于水溶液中,其所处的环境极性逐渐增加,因此蛋白质荧光发射峰的λmax逐渐增大。
λmax红移的程度可以反映蛋白质构象变化的程度,红移程度越大则表明蛋白质在变性过程中构象变化的程度越大。
反过来,蛋白质复性过程中,芳香族氨基酸分子的侧链逐渐内埋于蛋白质内部,其所处的环境极性逐渐降低,因此蛋白质荧光发射峰的λmax逐渐减小,称为λmax的蓝移。
通过测定蛋白质λmax蓝移的程度,可以推算其整体构象变化的程度。
2.利用荧光探针检测蛋白质的构象变化
由于荧光探针的荧光光谱对环境变化十分敏感,使得它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。
例如用ANS做荧光探针的时,它通过非共价结合到蛋白质分子的非极性区域中时,其荧光光谱会随着所处环境非极性的增加而发生蓝移,且荧光强度也随之提高,最大吸收/发射在375/500nm,在一定范围内,荧光强度与蛋白质的浓度呈线性关系。
利用ANS的这个性质,可以衡量ANS结合的蛋白质部位的极性的变化,根据极性的变化又可以进一步推测蛋白质结构的变化。
3.测定蛋白质的含量
利用蛋白质的内源荧光可以检测蛋白质的含量,主要有标准曲线和内标法两种。
标准曲线法是在同样条件下,以已知量的标准荧光蛋白质配成不同浓度的标准溶液,将在荧光光谱仪上测得的值绘成标准曲线,然后再测未知样品值,利用标准曲线求出荧光物质的含量。
内标法通常是在一定的浓度范围内,选择合适的标准蛋白溶液浓度,将其在荧光光谱仪上测得的值与在同样条件下测得的未知样品的值比较,计算求出未知样品的浓度。
蛋白质中伯胺还可以与荧光胺反应生成发荧光的化合物,其荧光强度与蛋白质的含量成正比,因此可利用荧光胺测定蛋白质的含量,但必须预先测定已知浓度的标准蛋白溶液的荧光强度[3]。
4.测定酶的活性
荧光光谱法是测定酶活性的一种方法,主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定,其灵敏度要比紫外及可见分光光度法高若干个数量级,而且荧光强度与激发光的光源有关,因此在酶活性的测定中越来越多地被采用,特别是用于一些快速反应的测活性场合。
荧光光谱法的一个缺点是易受其他物质干扰,例如酶本身的内源荧光的干扰。
故用荧光法测定酶活力时,尽可能选择酶的内源荧光较弱的可见光范围进行测定。
如乳酸脱氢酶(lac2tatedehydrogenase,LDH)的活性测定,乳酸脱氢酶可催化乳酸与氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico2tinamideadeninedinucleotide,NAD+)的反应,NAD+被还原为原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadininedinucleotide,NADH),NADH能被强碱转换成荧光化合物,则可以测定其荧光强度,用于度量乳酸脱氢酶的活性。
5.研究小分子与蛋白质间的相互作用
荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
在相互作用研究中常采用荧光猝灭法,荧光猝灭是指由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。
荧光猝灭法分为动态猝灭和静态猝灭两种方式[4]。
荧光猝灭法多用于研究生物大分子,如蛋白质与小分子药物或金属离子的相互作用,可引入外源性荧光作为探针,也可利用蛋白质自身的内源性荧光。
借助荧光猝灭法可测得药物分子与蛋白质的结合常数及结合点数,再依据Forster能量转移机制可求出供体与受体间的结合距离及能量转移效率[5]。
该法应用十分广泛[6-7],且常与紫外可见吸收光谱法及圆二色谱法一起使用,相互验证。
五、蛋白质荧光光谱研究的一些新方法
1.同步荧光光谱
同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。
由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图,即为同步荧光光谱。
它包括固定波长的同步荧光和固定能量的同步荧光两种光谱。
固定波长的同步荧光光谱首先由Lloyd[8]提出,固定能量的同步荧光光谱则随后由Imman[9]等人提出。
1)固定波长的同步荧光光谱
在同步扫描中,使激发波长和发射波长保持固定的波长间距,即在$K=Kem-Kex=常数的情况下进行扫描,以同步荧光信号(相对强度)对发射或激发波长测绘荧光光谱图,则为固定波长的同步荧光光谱。
在同步扫描的荧光测定中,同步荧光信号强度Is是激发波长的函数,其基本公式为[10]:
Is(Kex,Kem)=KcbEx(Kex)EM(Kem)
(1)
式中,c为待测物质的质量浓度,b为试样溶液的厚度,K为实验条件下某常数,Ex为激发光谱的强度分布,EM为发射光谱的强度分布。
由
(1)式可知,在实验条件保持固定的情况下,测试物质的同步荧光信号强度与待测物质的质量浓度成正比。
这是定量分析的依据。
在利用同步荧光测试样品前,$K值必须慎重选择,只有当$K恰好为某吸收带和其发射带之间的波长间距时,才能观察到同步信号。
2)固定能量的同步荧光光谱
固定能量的同步荧光光谱是指在同步扫描过程中,使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差,即使得$M=(1ö
Kex-1ö
Kem)×
107为常数,$M表示波数差(cm-1)。
固定能量的同步荧光法与固定波长的同步荧光法相比较,后者能消除瑞利散射,但是不能消除拉曼散射,反而使拉曼散射加宽。
固定能量的同步荧光法既能消除瑞利散射,又可消除拉曼散射,这有利于分析方法灵敏度和精密度的提高,故一般选用前一种方法。
如前所述,在构成蛋白质的20种氨基酸中,仅有芳香族氨基酸Trp、Tyr、Phe是发荧光的基团,但由于三者在普通荧光光谱中的激发光谱和发射光谱相互重叠,不能同时测定,给研究蛋白质的工作带来了困难,1979年Miller[11]用同步荧光光谱法分别获得了Trp和Tyr的特征光谱。
到目前为止,应用同步荧光光谱技术研究蛋白质的报道还比较有限。
Rao率先研究了眼晶体蛋白(crystallin)的荧光光谱,在$K=30nm条件下A、B、C2眼晶体蛋白的同步荧光光谱可以清楚地分开,可以提供特定的信号信息[12]。
Chou等研究了细胞色素C溶液的同步荧光光谱,发现细胞色C分子中的Trp和Tyr残基的同步荧光光谱可采用不同的波长差来分开,细胞色素C溶液的同步荧光光谱随溶液pH不同而变化反映了pH诱导的细胞色素C构象变化[13]。
2.三维荧光光谱法
三维荧光光谱法是20年前提出的一种荧光分析新方法。
特别是最近提出的三维荧光偏振光谱在研究溶液中荧光物质分子的行为特征方面具有较大的优越性。
三维荧光光谱是由激发波长(Y轴)2发射波长(X轴)2荧光强度(Z轴)三维坐标所表征的矩阵光谱(excitation2emission2matrixspectra),也叫总发光光谱(totalluminescencespectra),显然该技术可获得激发波长(Kex)与发射波长(Ke)同时变化时的荧光强度信息。
三维荧光光谱图的表示方式有三种,即三维投影图(isometricprojection)、激发发射矩阵(EEM)以及等高线(contourplot)荧光光谱图[14]。
用三维投影方式表示的荧光光谱,比较直观,较容易从图上观察到荧光峰的位置和高度以及光谱的某些特性。
三维荧光光谱图,由于比二维的平面图多了一个坐标,所得的总荧光数据又比普通荧光光谱多得多,故其具有高选择性。
10余年前,三维荧光光谱法开始应用于生物医药领域[14]。
最近,鄢远等人首次将三维荧光光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象[15]。
结果表明:
三维荧光光谱法是一种研究蛋白质溶液构象的很有效的分析方法。
该方法能够较直观地表明Trp残基在蛋白质分子中的微环境及其在不同条件下的构象变化,因而可望得到广泛的应用。
Chen等利用三维荧光光谱法研究了AaH¸
在不同介质中的构象变化[16]。
用EDTA脱去AaH¸
中的金属离子后,尽管Stoke位移保持不变,用等高线表示的apo2AaH,的三维荧光光谱发生了显著的变化,同时apo2AaH¸
的荧光强度降至只有天然AaH¸
的26%,结合其它实验结果证明了AaH¸
中的金属离子对于保持活性和维持其构象稳定都具有重要作用。
总之,荧光光谱法是研究溶液中蛋白质分子构象的一种有效的方法,其测定条件更接近生命体的生理环境,因而在蛋白质乃及生命科学研究中具有重要意义。
3.荧光共振能量传递分析
荧光共振能量转换(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是指两个荧光受色基团足够近时,供体分子吸收一定频率的光子后,被激发到更高的电子态,在回到基态前,通过偶极子相互作用实现能量向邻近的受体分子转移。
FRET由两部分组成:
镧系元素螯和物为能量供体,有机探针为受体。
FRET是进行结合分析(抗体2抗原;
受体2配体,肽2蛋白或蛋白2蛋白激酶分析)的理想工具。
此中分析基于两种标记:
能量供给长时间衰减螯和物标记;
短时间衰减有机接受体。
当标记物被带到非常接近结合反应时能量转移发生。
根据记录接收体的时间分辨荧光量来检测转移的能量。
结论
荧光光谱法是研究蛋白质结构和构象的一种有效方法,常与圆二色光谱、吸收光谱、核磁共振、电子自旋共振波谱等技术互相补充,给出更全面的数据和结果,成为蛋白质及生命科学研究中的有利工具。
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