BMP9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验分析Word下载.docx
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CO·
glycolide)聚乳酸/羟基乙酸共聚物
PGAPolyglycolicacid聚羟基乙酸
l
PLAPolylaciticacid聚乳酸
RPMRevolutionsperminute每分钟转速SEMScanningElectronMicroscopy扫描电镜TETissueEngineering组织工程
2
重庆医科大学研究生学位论文独创性声明
本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意.
申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任.
学位论文作者鲐之盘魄
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论文作者签名:
一£兰楚
p
指导教师签名:
略fb
日期:
BMP.9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞
异位成骨实验研究
摘要
创伤和手术后的骨缺损常需要植骨,故骨修复是骨科的基本问题。
将编码细胞因子的基因导入骨髓间充质质干细胞(BMSCs),再与合适的载体复合后植入骨缺损部位,可持续有效地表达细胞因子,诱导BMSCs向成骨细胞分化,促进骨愈合。
有研究证实,BMP.9基因转染可促进人BMSCs增殖及成骨转化。
本实验在此基础上,观察BMP.9基因修饰的兔BMSCs在PLGA支架中附着、生长情况,为进一步应用此组织工程
骨修复骨缺损奠定基础。
将细胞与可降解类生物材料等复合物移植于缺损部位替代修复骨缺损是一种新的尝试。
本实验在基因修饰骨髓间充质干细胞的基础上,将细胞与可降解生物材料PLGA复合物在体外短暂培养后移植到兔臀部肌袋内,观察其异位成骨的能力,探讨一种实用性的骨缺损组织工程修复材料。
目的:
通过人骨形态发生蛋白.9(BMP.9)基因修饰兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),接种PLGA(聚乳酸/羟基乙酸共聚物)支架体外构建组织工程骨;
并将复合物移植到兔臀部肌袋内异位成骨,探索BMP.9基因治疗与组织工程技术相结合的可行性。
方法:
贴壁法培养兔骨髓MSCs,体外应用阳离子脂质体介导转染pEGFP.BMP-9基因:
荧光显微镜观察及流式细胞学检测观察转染效率;
3
MSCs碱性磷酸酶活性半定量测定及VonKossa’s钙结节染色观察转染前后细胞功能变化;
将转染及未转染基因的MSCs与PLGA支架共培养,体外构建组织工程骨,荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs在PLGA支架上的黏附、生长状况。
短暂体外培养后手术将MSCs—PLGA复合物分组移植到兔臀部肌袋内;
于不同时间点(2W、4W、8W)行X线摄片和组织切片行HE染色观察骨基质的生成情况,及进行新骨成骨面积分析,并于(4W、8W)进行组织标本ALP测定。
结果:
流式细胞学测定阳离子脂质体介导的质粒转染率为34.15%;
转染组MSCs的ALP活性较未转染组明显增高(p<
O.05),VonKossa’S钙结节染色比较转染细胞形成的钙结节明显大于未转染组;
荧光显微镜及扫描电镜观察见MSCs在PLGA支架上的黏附、生长良好。
异位成骨4WX线摄片见实验组有骨组织成像显示,8W后显影增大,对照组4W时未见显影,8W时可见模糊显影出现;
4W、8W组织切片HE染色见:
空白对照PLGA孔隙内无新骨形成,对照细胞组内有部分新生骨形成,而
BMP.9实验组形成的新生骨组织面积更大(P<
O.05)。
4W、8W组织ALP检测显示实验组表达活性明显较实验对照组强(P<
结论:
BMP.9基因转染BMSCs,可促进细胞向成骨细胞增殖分化。
转染后细胞在PLGA支架上生长良好,BMP.9基因修饰的组织工程骨构建成功。
应用BMP.9基因修饰的MSCs作为骨组织工程的种子细胞,可望取得更强的成骨能力。
关键词骨髓间充质干细胞,BMP.9,PLGA,组织工程
ECTOPICBoNEFoRMATIoNOFBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSTRANSFERMEDIATEDBYHUMANBONEMORPHOGENETICPROTEIN.9
GENEINRABBITABSTRACT
ObjectivehBMP-9genetherapycombinedwithtissue-engineeringtechniqueswasexploredtoimproveosteogenesisinanectopicboneformationmodelinrabbits.
MethodAutologousrabbitMSCswereculturedandtransfectedwithpEGFP-BMP-9genebylipofectamine,fluorescentmicroscope、Flowcytometer(FCM)、ALPactivityquantitativeassayandVonKossa’Scalciumnodusstaninigweredetected;
PLGAWaspreparedandMSCsinfectedby
BMP-9genewithcationicliposomewereseededontoit.Scanning
electronicmicroscopyasusedtoobservecellmatrixinteraction.Thecellsinfectedandnon-infectedwerecombinedwithPLGAtoconstructtissue—engineeredbonesrespectively.Theywerefurtherimplantedinto
rabbitssubcutaneously.Fourandeightweeksaftersurgery,theimplants
wereevaluatedwithX—raysphotographsandhistologicalstaining.
ResultThetransfectionefficiencyofMSCsinfectedbyBMP.9genewithcationicliposomedetectedbyFCMwas34.15%,theALPactivityofinfectedMSCswashigherthanthatofnon-infectedMSCs(p<
O.05),the
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calciumnodusofMSCsformationofBMP一9geneinfectedgroupweremanifestlargerthanthenon—infectedgroup;
PLGApreparedwasagrid—likeporousstructure,withdefiniteductilityandstrength,andcouldbetrimmedintodifferentmodels.MSCsseededontoPLGAshowedhighlevelofproliferation,andmasssynthesisofcellmatrixwasobservedwithscanningelectronicmicroscopy.Intheectopicboneformationmodel,fourweeksaftersurgery,intheX—raysphotographsthecanseebonetissueimageformationoftheexperimentalgroup,andtheimagebecameaugmentationineightweeks;
thenewboneareaformedinthenon.infected
MSCsgroupwaslowerthantheBMP一9geneinfectedgroup(p<
O.05).TheALPactivityintheexperimentsideWasobviouslyhigherthanthatinthecontrolside(p<
O.05).
ConclusionBMP·
9genemodifiedMSCscouldenhanceectopic
newboneformationinrabbits.TheseresultsindicatedthattheMSCstransfermediatedbyrhBMP-9genewithcationicliposomecombinewithPLGAmightbesuitableforbonetissueengineeringapplications.
KeyWordsMSCs,BMP一9,PLGA,TissueEngineering
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BMP.9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究
.■厶—J-
刖昌
骨缺损是指由于外伤、感染、肿瘤、骨坏死及先天畸形等多种疾病引起的骨质丧失,从而在骨组织中形成间隙。
较小范围的骨缺损可以由机体自身的再生得到修复,而大间隙的骨缺损则由于成骨细胞难以越过而不能正常愈合,若不采用适当治疗则最终仅由纤维组织充填,形成骨不连。
有研究表明,当长骨骨干缺损长度超过其直径的1.5~2.5倍时,机体便难以自愈,因而造成永久性骨不连。
骨缺损的病人在骨科患者中占有很高的比例,大约有10-15%的病人需要进行骨移植治疗。
在美国,每年涉及骨移植的病例已超过100万,而我国在这样一个人口众多的发展中国家,需要进行骨移植治疗的病例数目巨大更是不言而喻的,而且随着社会的发展,交通事故的增多,骨缺损的病人数目更是在不断的逐年攀升,现今已经发展成为严重威胁人们生活质量的主要病症之一。
骨缺损修复一直是骨科领域的难题之一,目前常用的异体骨移植、自体骨移植、人工合成替代物等均在不同程度上存在一些问题。
自体、异体骨移植等常用治疗方法存在供量不足、排异反应等并发症。
近二十年来,组织工程学的发展为骨缺损的修复开辟了新的途径。
组织工程学是应用生命科学和工程学的原理及其技术,以生物材料为载体,研究开发、设计构建或重建具有生理功能的组织和器官,然后移植到人体,成为具有修复、维持或改善受损组织功能的生物替代物的一门新兴交叉学科Il】。
现代组织工程包含三大要素:
1.种子细胞;
2.支架材料;
3.细胞因子。
要想获得组织再生的良好效果,三大要素缺一不可。
因此,如何获得更加理想的种子细胞,以及细胞因子的选择和使用方式一直都是研究的重心。
近年来,将细胞与特定支架材料联合培养,形成具有生命的活性组织工程化复合材料用于修复骨缺损已经取得了初步成效,但毫无疑问,如何构建更理想的组织工程化骨仍是一个值得被重视的热点。
MSCs是一类具有自我更新能力和多分化潜能的多能干细胞,能够分化为脂肪
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细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、神经细胞等中胚层起源的细胞,而对于MSCs在骨组织工程中的应用,单纯的MSCs与材料的复合物诱导骨化的过程很慢,而细胞因子局部给药持续时间短、需反复给药,并且价格非常昂贵。
我们则希望能够通过一定的手段控制其向成骨细胞定向分化,将编码细胞因子的基因导入到MSCs中,复合适当材料后植入缺损步,这样能够在局部持续高效地产生细胞因子,以自分泌和旁分泌的方式诱导MSCs和组织中间充质干细胞的成骨分化,促进骨缺损的修复。
在众多细胞因子中BMPs是最有希望的,相对于其他BMPs家族成员,本实验选用的BMP.9是新近发现,研究相对较少的BMPs一种亚型。
国外有研究[21发现BMP.9是BMPs家族最具潜力的促成骨分化生长因子之一,其诱导干细胞成骨的作用甚至强于目前该领域研究的BMP.2、7。
与其他BMPs相比,BMP.9介导的骨分化作用不受BMP.3的影响,而其他成骨作用明显的BMP.2、BMP.6和BMP.7可以被抑制。
在本实验中,我们以兔骨髓MSCs作为转基因的靶细胞,将骨形态发生蛋白.9基因导入MSCs中,在体外种植于PLGA支架上,分别在体内和体外观察对比了BMP.9基因修饰对MSCs活性的影响以及诱导异位成骨的情况,为构建更优化的骨组织工程种子细胞和组织工程化骨提供了重要的实验基础。
另外,本实验选用的PLGA是PLA和PGA的共聚物,具有良好空间立体结构、可在体内良好降解的三维多孔材料,充分融合了PGA和PLA二者的优点、规避了二者的缺陷,是目前骨组织工程中使用较多的成熟的可降解生物支架材料【3】。
所用的PLGA是25%PGA:
75%PLA的共聚物是商品化的成熟产品,具有良好的孔隙率和密度,是适用于骨组织工程的支架材料。
MSCs作为一种存在于骨髓中的中胚层来源的未分化的间充质干细胞,能够通过细胞因子的调节控制其增殖分化过程,改变细胞内各种物质的合成和分泌,产生能够反应成骨特异性的标记14J:
I型胶原、ALP、OCN等,从而参与新骨形成的过程。
ALP是成骨细胞早期分化的标志,OCN主要在矿化形成期出现,是成骨细胞成熟的标志,ALP和OCN的表达程度可以反应骨的形成进程。
因此,本试验的研究主要任务是在体外通过脂质体介导BMP.9基因转染转染MSCs:
荧光显微镜观察及流式细胞学检测观察转染效率;
MSCs碱性磷酸酶活性半定量测定及VonKossa’s钙结节染色观察转染前后细胞功能变化;
荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs
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在PLGA支架l-_f搀黏附、生长状况;
X线摄像及组织切片染色等观察异位成骨情况。
1.材料
1.1主要仪器及材料:
自动平衡离心机上海医用分析仪器厂
台式离心机EPPENDOF(德国)
低温台式离心机EPPENDOF(日本)
凝胶成像及分析系统..BIO.RAD(美国)紫外分光光度仪。
岛津(日本)
紫外投射仪UVITEC(英国)
电泳系统BIO.RAD(美国)
超净工作台THERMO(美国)
电子恒温摇床..THERMO(美国)
电子分析天平METTLERTOLEDO(瑞典)
JTT.5架盘药物天平.上海医用激光仪器厂
恒温水箱上海跃进医疗器械厂
加样器。
EPPENDOF(德国)
移液器SOCOREX(瑞士)
DELTA320pH计METTLERTOLEDO(瑞典)
超低温冰箱THERMO(美国)
医用冰箱SANYO(日本)
磁力搅拌器。
上海司乐仪器有限公司
倒置荧光相差显微镜..NIKON(日本)
电子显微摄像系统NIKON(日本)
液氮容器成都金风液氮容器公司
压力蒸汽消毒器.HTRAYAMA(日本)
电热鼓风干燥箱上海福玛实验设备有限公司C02孵箱BIO.RAD(美国)
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Milli--QBiocel超纯水系统..Millipore(美国)制冰机SCOTSMAN(美国)
流式细胞仪.BECTONDICKINSON(美国)
酶标仪TECAN(奥地利)
扫描电镜AMRAY(美国)
切缝包,骨穿针,肝素,等常规药品及材料。
1.2菌株及质粒:
菌株:
E.coliDH5a(本实验室保存);
质粒:
pcDNABMP-9(重庆医科大学附属儿童医院康权博士构建并惠赠);
plRES2-EGFP质粒(重庆医科大学康权博士馈赠);
1.3主要试剂及配制:
1.3.1主要试剂:
DMEM/F.12培养基GIBCO(美国)特级胎牛血清TBD(杭州四季青公司)青霉素华北制药股份有限公司
链霉素华北制药股份有限公司
HEPESSIGMA(美国)
限制性内切酶NheI、XhoINEB(美国)GenExtractTM质粒中量抽提无内毒素试剂盒道普生物科技(北京)胰蛋白酶SIGMA(美国)
DMSO华美公司
LipofectaminerM2000INVITROGEN(美国)
ALP测定试剂盒建成生物工程研究所(南京)
PLGA材料岱罡科技有限公司(济南)
其它常规试剂等。
1.3.2试剂配制:
细胞培养相关试剂
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(!
)DMEM—FI2培养液配制
取1000ml消毒过的大烧杯,注入约800mml的消毒过的三蒸水,首先加DMEM/F12培养基一包,溶解后,再加5.0g碳酸氢钠,加入HEPESl0.0g,加入葡萄糖3.09,加入青霉素10万u(终浓度100u/m1),链霉素6.5万u(终浓度100u/m1),定容至1000ml后调PH值(7.0~7.2),在超净台上抽滤除菌,并分装至11个100ml盐水瓶中,盖好瓶塞,用牛皮纸扎口,放在.20。
C冰箱中保存备用。
每次使用取出一瓶,无菌条件下加入已分装的灭活胎牛血清10ml后使用。
解冻后的培养液用后置于4℃保存。
②血清将冻存的100ml优等特级胎牛血清先置于室温下3h使其自然融化,然后置于
56"
(2水浴30min灭活补体;
消毒25ml血清瓶5个,无菌条件下分装后一20。
C冰箱
保存备用。
③胰蛋白酶称取胰蛋白酶0.259,然后再用消毒好的PBS液100ml溶解后抽滤,在无菌台
上分装在消毒后的25ml血清瓶内,放于.20℃冰箱冻存。
@PBS(pH7.0~7.4)-
取NaCI8.09,KCl0.29,无水Na2HP041.29,KH2PO,0.29,调pH值(7.叽7.4),三蒸水定容至lL,抽滤分装至10个100ml盐水瓶中,盖好瓶塞,用牛皮纸扎口,120℃,20min消毒,常温保存备用。
DH5a细菌培养相关:
①LB液体培养基的配制取精解蛋白胨5.Og,酵母浸出粉2.59,氯化钠5.09,溶于500ml三蒸水,用
5mmolNaOH调PH值7.0;
分装为100ml后120"
t2,20min消毒;
恒温水箱冷却至60℃,加入所需抗生素(kan,终浓度为50I_tg/1),再直接室温冷却;
所有培养基4℃保存备用。
②LB固体培养基的配制及平板制作称取1.59琼脂粉(Agar),加入到上面所配置的100mlLB液体培养基中,溶
解摇匀;
120。
C,20min消毒;
立即置于60"
C恒温水箱降温,半小时后:
加入所需
抗生素卡那霉素(Kan),轻轻摇匀;
准备好tpl0cm塑料平板于消毒之超净台上;
11
从水箱取出液态LB固体培养基后,尽快转移至超净台,小心倒入预备各平板中,厚度约3mm左右:
Agar凝固后立即倒扣平板,防止盖上之冷凝水污染培养基;
3h后用消毒纸巾小心抹去底盖冷凝水;
扣好板盖,封口胶双层密封后4。
C保存备用;
③抗生素配配制卡那霉素(Karl):
三蒸水配制10mg/ml工作液;
9220nm滤纸过滤后避光保存;
(使用前)取5ml(50mg)加入1000mlLBmedium(或LBAgar)中;
最终工作液浓度:
5099/ml。
电泳相关试剂
①TAE的配制(1L工作液):
啊s乙酸7.569+EDTA0.3729,三蒸水定容至lL备用;
②esn的配制:
0.25%溴酚蓝(O.259)+40%蔗糖(409),三蒸水定容至100ml备用。
1.4实验动物:
2~3月龄新西兰大白兔。
2.方法‘
2.1MSCs的准备:
2.1.1MSCs的分离、培养:
新西兰大白兔全麻,侧卧位,双后肢自然伸直、交叉,暴露下面后肢内侧胫骨平台,备皮,碘酒、75%酒精常规消毒,铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右,以利于减少污染),使用20ml的无菌注射器吸取O.1~o.2毫升含1000单位的肝素化生理盐水(使针道内壁肝素化,防止吸取粘稠骨髓时出现针道内的溶血),于胫骨平台穿刺吸取骨链。
穿刺针首先快速穿透皮肤进针0.5~0.8cm后,可感到明显落空感,匀速抽取骨髓血。
同法穿刺对侧,共可得骨髓血5m
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- 关 键 词:
- BMP9 基因 修饰 骨髓 间充质 干细胞 异位成骨 实验 分析