化妆品微生物检验标准Word下载.docx
- 文档编号:16289537
- 上传时间:2022-11-22
- 格式:DOCX
- 页数:13
- 大小:24.10KB
化妆品微生物检验标准Word下载.docx
《化妆品微生物检验标准Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《化妆品微生物检验标准Word下载.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
)灭菌液体石蜡和吐温80。
3
(2)仪器
1)天平、水浴箱、灭菌研钵及灭菌研棒、均质器;
2)灭菌三角瓶:
内含玻璃球及90mL稀释液;
3)灭菌刻度吸管:
10mL、5mL;
(3)不同类型样品制备
1)水溶性的液体样品:
可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中,如样品少于10mL,仍按10倍稀释法进行。
如为5mL,则加45mL灭菌生理盐水,混匀后,制成(1?
10)的稀释液。
2)油性液体样品:
取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀,再加10mL灭菌吐温80,在(40,44)?
水浴中振荡混合10min,加入灭菌的生理盐水75mL(在40,44?
水浴中预温),在(40,44)?
水浴中乳化,制成(1?
10)的悬浮液。
3)亲水性半固体样品:
称取10g样品,加到已加有90mL灭菌生理盐水并带玻璃球的经过灭菌的三角瓶中,充分振荡混匀,放入32?
水浴静置15min。
用其上清液作为(1?
4)疏水性半固体样品:
称取10g样品,放到经灭菌的研钵中,加10mL灭菌液体石蜡,研磨成粘稠状,再加10mL灭菌吐温80,研磨,等溶解后,加70mL灭菌生理盐水,在(40,44)?
水浴中充分混合,制成(1?
如有均质器,上述水溶性膏霜、半固体样品、粉剂固体样品,可称取10g加90mL灭菌生理盐水,均质(1,2)min;
疏水性膏霜及眉笔、口红笔等,称取10g加90mLSCDLP液体培养基或1g样品加lmL灭菌液体石蜡、lmL灭菌吐温80、7mL灭菌生理盐水,均质(3,5)min。
8.5.2细菌总数测定
细菌总数系指1g或1mL化妆品中所含的活菌数量。
测定细菌总数可用来判断化妆品被细菌污染的程度,以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况,是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
这里主要介绍标准平板计数法。
1(测定原理
化妆品中污染的细菌种类不同,每种细菌都有它一定的生理特性。
培养时对营养要求、培养温度、培养时间、pH、需氧性质等均有所不同。
在实际工作中,不可能做到满足所有菌的要求。
因此测定的结果,只包括在本方法所使用的条件下(在卵磷脂、吐温80营养琼脂上,于37?
培养48h)生长的一群嗜中温的需氧及兼性厌氧的细菌总数。
2(仪器
(1)三角烧瓶、量筒、高压消毒锅、试管、酒精灯、恒温培养箱、放大镜、pH计或精密pH试纸。
(2)灭菌平皿:
直径9cm;
灭菌刻度吸管:
10mL。
3(培养基和试剂
(1)生理盐水:
见供检样品的制备。
(2)卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基:
配方见表8-15所示。
表8-15卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基配方
物质质量/g物质质量/g
蛋白胨20卵磷脂1
牛肉膏3吐温807
NaCl5琼脂15
蒸馏水1000
先将卵磷脂加到少量蒸馏水中,加热溶解,加入吐温80,将其它成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中溶解,将已溶解的卵磷脂和吐温80混匀,调pH为7.1,7.4,加入琼脂在0.1MPa压强下高压灭菌20min,储存于冷暗处备用。
4(测定步骤
用灭菌吸管,吸取按1?
10稀释的检样2mL分别注入到两个灭菌平皿内,每皿lmL,另取lmL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面),更换一支吸管,并充分混匀,使成1?
100的稀释液,吸取2mL,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿lmL。
如样品含菌量高,还可再稀释成1?
1000、1?
10000……等,每种稀释度应换1支吸管。
将熔化并冷至(45,50)?
的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾注平皿内,每皿约15mL,另倾注一个不加样品的灭菌空平皿,作空白对照,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置37?
培养箱内培养48h。
5(菌落计数方法
先用肉眼观察,对菌落数进行计数,然后再用放大5,10倍的放大镜检查,以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后,求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数,若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌蔓延生长时,该平皿不宜计数。
若片状菌落不到平皿中的一半,而其余一半中菌落数分布又很均匀,则可将此半个平皿菌落计数后乘2,以代表全皿菌落数。
6(菌落计数及报告方法
(1)首先选取平均菌落数为30,300的平皿,作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表8-16,例1)。
2)若有两个稀释度,其平均菌落数均为30,300个,则应求出两者菌落总数之比值(
来决定。
若其比值小于或等于2,应报告其平均数,若大于2则报告其中较小的菌数(见表8-16,例2及例3)。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300个,则应按稀释度高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表8-16,例4)
(4)若所有稀释度的平均菌落数均少于30个,则应按稀释度的最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表8-16,例5)。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均不是30,300个,其中一个稀释度大于300个,而相邻的另一稀释度小于30时,则以接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表8-16,例6)。
(6)若所有的稀释均无菌生长,报告数为每克或每毫升小于10个。
(7)菌落计数的报告,菌落数在10以内时,按实有数值报告之;
大于100时,采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,应以四舍五入法计算。
为缩短数字后面零的个数,可用10的指数来表示(见表8-16报告方式栏)。
在报告菌落数为“不可计”时,应注明样品的稀释度。
表8,16细菌计数结果及报告方式
不同稀释度的平均菌落数例两稀释度菌落总数报告方式
-1-2-3次菌数之比(个/g或个/mL)(个/g或个/mL)101010
41/16420/1640016000或1.6×
10
422760295461.63800038000或3.8×
432890271602.22710027000或2.7×
54不可计4650513/513000510000或5.1×
2527115/270270或2.7×
46不可计30512/3050031000或3.1×
8.5.3粪大肠菌群的检验
粪大肠菌细菌来源于人和温血动物的粪便。
检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染,有可能存在其它肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。
因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。
检验方法是根据粪大肠菌群所具有的生物特征,如革兰氏阴性无芽孢杆菌在44?
培养(24,48)h能发酵乳糖产酸并产气,能在选择性培养基上产生典型菌落,能分解色氨酸产生靛基质。
恒温水浴、温度计、显微镜、载玻片、接种环、电炉、三角瓶、试管、小倒管、pH计或pH试纸、高温消毒锅、灭菌吸管、灭菌平皿。
(1)乳糖胆盐培养基:
配方见表8-17所示。
表8-17乳糖胆盐培养基配方
物质用量物质用量
蛋白胨20g0(4,溴甲酚紫水溶液2.5mL
猪胆盐5g乳糖5g
蒸馏水1000mL
将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中,调pH到7.4,加入指示剂,混匀、分装试管(每支试管中加一个小倒管),在69kPa压力下灭菌20min。
(2)双倍浓度乳糖胆盐培养基
按上述乳糖胆盐培养基成分,蒸馏水量不变,其它成分加倍。
(3)伊红美兰(EMB)琼脂:
配方见表8-18所示。
表8-18伊红美兰(EMB)琼脂配方
蛋白胨10g2,伊红水溶液20mL乳糖10g0.5,美红水溶液13mL磷酸氢二钾10g琼脂20g蒸馏水1000mL
先将琼脂加到900mL蒸馏水中,加热溶解,然后加磷酸氢二钾、乳糖及蛋白胨混匀,使之溶解。
再以蒸馏水补足至1000mL,校正pH为7.2,7.4。
分装于烧瓶内。
在0.1MPa压力下高压灭菌15min,备用。
临用时加入乳糖并加热熔化琼脂。
冷却至60?
左右,以无菌方式加入经灭菌的伊红美兰溶液,摇匀,倾注平皿备用。
(4)蛋白胨水(作靛基质试验用):
配方见表8-19所示。
表8-19蛋白胨水配方
蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化钠5g蒸馏水1000mL
将上述成分加热熔化,调pH为7.0,7.2,分装小试管,在0.1MPa压力下高压灭菌15min。
(5)靛基质试剂
柯凡克试剂:
将5g对二甲氨基苯甲醛溶解到75mL戊醇中,然后缓缓加入浓盐酸25mL。
试验方法:
接种细菌于蛋白胨水中,于44?
培养(24,48)h。
沿管壁加柯凡克试剂(0.3,O.5)mL,轻摇试管。
阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
蛋白胨应含有丰富的色氨酸,每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
(6)革兰氏染色法
1)染液制备:
按表8-20制备染液。
表8-20染液的制备方法
成分制备方法
将结晶紫1g溶于20mL95%的乙醇中,然后与80mL1%的草酸铵溶A、结晶紫染色液液混合
先将1g碘和2g碘化钾进行混合,加入少许蒸馏水,充分振荡。
待完全B、革兰氏碘液溶解后,再加蒸馏水至300mL。
C、脱色液95%乙醇
a(沙黄复染液将0.25g沙黄溶于10mL95%的乙醇,然后用90mL蒸馏水稀释。
D、
复称取碱性复红10g,研细,加95%乙醇100mL,放置过夜,滤纸过滤。
染b(稀石炭酸复红液取滤液10mL,加5%石炭酸水溶液90mL,即为石炭酸复红液。
再取此
液液10mL,加水90mL,即为稀石炭酸复红液。
2)染色法
?
将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染lmin,水洗。
滴加革兰氏碘液,作用lmin,水洗。
滴加95,酒精脱色,约30s,或将酒精滴满整个涂片,立即倾去,再用酒精滴满整个涂片,10s后水洗。
滴加复染液,复染lmin,水洗。
待干,镜检。
3)染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
如用1?
10稀释石碳酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。
(1)取10mL1?
10稀释的样品,加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中,置44?
培养箱中培养(24,480h。
如不产酸也不产气,则报告为粪大肠菌群阴性。
(2)如产酸产气,则划线接种到伊红美兰琼脂平板上,在37?
培养(18,24)h,同时取该培养液(1,2)滴接种到蛋白胨水中,在44?
培养24h。
经培养后,在上述平板上
观察有无典型菌落生长,大肠菌群在伊红美兰琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉紫色,中心较深的菌落,亦常为大肠菌群,均应注意挑选。
(3)挑选上述可疑菌落,涂片做革兰氏染色镜检。
(4)在蛋白胨水培养液中,加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应,阳性者液面呈玫瑰红色;
阴性反应液面呈试剂本色。
5(检验结果
平板上有典型菌落,并经证实为革兰氏阳性短杆菌,靛基质试剂验阳性,则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
8.5.4绿脓杆菌的检验方法
绿脓杆菌在自然界分布甚广,空气、水、土壤中均有存在。
它对人体致病,常引起人皮肤化脓感染,特别是烧伤、烫伤、眼部疾病者被感染后,常使病情恶化,并可引起败血症。
因此,在化妆品标准中规定不得检出绿脓杆菌。
1(检验原理
其检查方法是根据绿脓杆菌生物学特征:
革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性,能产生绿脓菌素。
此外,还能液化明胶,还原硝酸盐为亚硝酸盐,在42?
下生长等。
可与类似菌相区别。
2(仪器
培养箱、三角烧瓶、试管、灭菌平皿、灭菌刻度吸管、显微镜、载玻片、接种针或接种环、电炉、高压消毒锅。
(1)SCDLP液体培养基
制备方法与前述SCDLP液体培养基制备一致。
(2)十六烷基三甲基溴化铵培养基:
配方见表8-21所示。
表8-21十六烷基三甲基溴化铵培养基配方
牛肉膏3g十六烷三甲基溴化铵0.3g
蛋白胨10g琼脂20g
NaCl5g蒸馏水1000mL
除琼脂外,将上述物质混合加热溶解,调pH为7.4,7.6,加入琼脂,在69kPa压力下灭菌20min后,制成平板,备用。
。
(3)乙酰胺培养基:
配方见表8-22所示。
表8-22乙酰胺培养基配方
乙酰胺10.0gNaCl15.0g
KHPO1.39g酚红0.012g24
KHPO0.73gMgSO?
7HO0.5g2442
琼脂20g蒸馏水1000g
除琼脂和酚红外,将其它成分加到蒸馏水中,加热溶解,调pH为7.2,加入琼脂、酚红,在0.1MPa压力下高压灭菌20min后,制成平板,备用。
(4)绿脓菌色素测定用培养基:
配方见表8-23所示。
表8-23绿脓菌色素测定用培养基配方
蛋白胨20g琼脂18g
MgCl1.4g甘油(化学纯)10g2
KSO10g蒸馏水1000mL24
将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中,加温使之溶解,调pH至7.4,加入琼脂和甘油,加热溶解,分装于试管内,在69kPa压力下高压灭菌20min后,制成斜面,备用。
(5)明胶培养基:
配方见表8-24所示。
表8-24明胶培养基配方
牛肉膏3g蛋白胨5g
明胶120g蒸馏水1000mL
取各成分加在蒸馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解,调pH至7.4,分装于试管内,经在69kPa压力下灭菌20min后,直立制成高层,备用。
(6)硝酸盐蛋白胨水培养基:
配方见表8-25所示。
-25硝酸盐蛋白胨水培养基配方表8
蛋白胨10g亚硝酸钠0.5g酵母浸膏3g硝酸钾2g蒸馏水1000g
将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中,加温使溶解,调pH值为7.2。
煮沸过滤后补足液量,加入硝酸钾和亚硝酸钠,溶解混匀,分装到加有小倒管的试管中,在69kPa压力下灭菌20min后,备用。
(7)普通琼脂斜面培养基:
配方见表8-26所示。
表8-26普通琼脂斜面培养基配方
蛋白胨10gNaCl5g
琼脂15g蒸馏水1000mL
牛肉膏3g
除琼脂外,其余成分溶解于蒸馏水中,调pH为7.2,7.4,加入琼脂,加热溶解,分装试管,在0.1MPa压力下高压灭菌15min后,制成斜面,备用。
4(检验步骤
(1)增菌培养:
取1?
10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中,置42?
培养箱中,培养(18,24)h,如有绿脓杆菌生长,培养液面会有一层薄菌膜,培养液呈黄绿色或蓝绿色。
如无SCDLP液体培养基时,可用普通肉汤培养基。
检验含防腐剂的化妆品时,在每1000mL普通肉汤中加1g卵磷脂,7g吐温80。
(2)分离培养:
从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上。
置37?
培养(18,24)h。
凡绿脓杆菌在此培养基上,其菌落为扁平无定型,向周边扩散或略有蔓延。
表面湿润,菌落呈灰白色。
菌落周围培养基常有水溶性色素扩散。
此培养基选择性强,大肠艾希氏菌不能生长,革兰氏阳性菌生长较差。
也可以用乙酰胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平皿中,放37?
培养24h,绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其它菌不生长。
(3)染色镜检:
挑取可疑的菌落,涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阳性者进行氧化酶试验。
(4)氧化酶试验:
取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的10g,L二甲基对苯二胺试液,在(15,30)s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性;
若培养物不变色,氧化酶试验阴性。
(5)绿脓菌素试验:
取可疑菌落(2,3)个,分别接种在绿脓菌素测定用培养基上,37?
培养24h,加入氯仿(3,5)mL,充分振荡,使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内,待氯仿提取液呈蓝色时,用吸管将氯仿移到另一试管中,并加入lmol,L的盐酸lmL左右,振荡后,静置片刻。
如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在。
(6)硝酸盐还原产气试验:
挑取被检的纯培养物,接种在硝酸盐胨水中,于37?
培养24h,观察结果。
凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者,即为阳性,表明该菌能还原硝酸盐,并将亚硝酸分解产生氮气。
(7)明胶液化试验:
取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物,穿刺接种在明胶培养基中,于37?
培养24h,取出放入冰箱(10,30)min,如仍是溶解状即为明胶液化试验阳性,如凝固不溶者为阴性。
(8)42?
生长试验:
提取纯培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,放在(41,42)?
培养箱中,培养(34,48)h,绿脓杆菌能生长,为阳性。
近似的荧光假单胞菌则不能生长。
(9)检验结果报告:
被检样品经增菌分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者,即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌;
如绿脓菌素试验阴性而液化明胶,硝酸盐还原产气和42?
生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。
8.5.5金黄色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌在外界分布较广,抵抗力也较强,能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症,因此化妆品中检验金黄色葡萄菌有重要意义。
美国CTFA和FDA检验化妆品中的金黄色葡萄球菌时,不经增菌直接接种到Vogel-Johnoson琼脂培养基上;
日本方法则先用SCDLP或SCD液体培养基增菌后,再接种Vogel-Johnoson琼脂培养基。
经试验证明增菌后检出效果好。
故我国采用先增再分离方法。
分离金黄色葡萄球菌的培养基很多,如Vogel-Johnoson琼脂、Baird-Parker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等。
考虑到国内的习惯应用,可采用Baird-Parker琼脂或血琼脂。
下一步的检验各国都相同。
根据本菌特有的形态及培养特性,用Baird-Parker平板进行分离,该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长,丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长,以提高检出率,并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征来鉴别。
2(培养基和试剂
(1)SCDLP液体培养基制备方法与前述SCDLP液体培养基制备一致。
(2)7.5%氯化钠肉汤培养基:
配方见表8-27所示。
表8-277.5%氯化钠肉汤培养基配方
成分组成成分组成
蛋白胨10g氯化钠75%
牛肉膏3%蒸馏水1000mL
将上述成分加热溶解,调pH为7.4,分装,121?
,1.5min高压灭菌
(3)Baird-Parker平板:
配方见表8-28所示。
表8-28Baird-Parker平板配方
胰蛋白胨10g氯化锂(LiCl?
6H2O)5g
牛肉膏5g琼脂20g
酵母浸膏1g蒸馏水(pH7.0?
0.2)950mL
甘氨酸12g
增菌剂的配制:
30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。
Baird-Parker平板制备方法:
将各成分中到蒸馏水中,加热煮佛完全溶解,冷至25?
校正pH。
分装每瓶95mL高压灭菌15min。
临用时热溶化琼脂,每95mL加入预热至50?
的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL,摇匀后倾注于平板。
培养基应的致密不透明的。
使用前在冰箱贮存不得超过48h。
(4)血琼脂培养基:
配方见表8-29所示。
表8-29血琼脂培养基配方
营养琼脂100mL脱纤维羊血(兔血)10mL
将营养琼脂加热溶化,待冷至50?
左右以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,制成平板,置冰箱内备用。
(5)甘露醇发酵培养基:
配方见表8-30所示。
-30血琼脂培养基配方表8
蛋白胨10g牛肉膏5g
氯化钠5g0
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 化妆品 微生物 检验 标准
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)