发酵工程Word下载.docx
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6微生物工程技术主要包括哪些内容?
1、提供高性能生产菌种的菌种技术;
2、实现低成本大规模生产产品的发酵技术;
3、最终获得合格产品的分离提取技术。
7微生物工程的发展简史主要经历了哪几个阶段?
(1)传统的微生物发酵技术--天然发酵阶段
(2)第一代微生物发酵技术--纯培养技术的建立阶段
(3)第二代(近代)微生物发酵技术一-深层培养技术(通气搅拌技术)的建立阶段
(4)第三代微生物发酵技术---微生物工程阶段
8微生物工程的发展趋势是什么?
1.提高现有微生物发酵工业水平
2.利用重组DNA技术,人工选育和改良菌种
3.开拓极端酶
4.采用发酵技术进行高等动植物细胞培养
5.随着酶工程的发展,固定化(酶和细胞)技术被广泛应用
9微生物工程(发酵工程)的工业生产水平主要取决于()、()、()。
生产菌种的性能;
发酵及提纯工艺条件;
生产设备
10什么是菌种选育?
菌种选育是指应用微生物遗传和变异的理论,用人工方法造成变异,再经过筛选以得到人们所需的菌种的过程。
11菌种选育工作的重点:
是从()、()、()等方向进展。
常温菌到高温菌;
慢生菌到速生菌;
野生菌到变异菌
12将生态学方法用于培养分离的一般思路要点是什么?
1.罗列出所要分离的微生物类群;
2.根据所采集样本的各种生态参数,描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地;
3.将若干样本分成若干类型,如植物和植物各部,土壤(类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等;
4.罗列出所要考察和测量的环境参数,如pH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等;
5.列出生物系统中有用的自然底物,如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶;
6.根据上述1-5项中所获得的数据,设计分离方法,即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件;
7.用标准方法作对照来评价生态学分离方法;
8.根据待检材料的生态参数需要,修改已知的方法;
9.运用特定的富集方法,富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。
13筛选目的菌株时必须考虑的重要指标有哪些?
(1)菌的特征:
在发酵过程中,一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料(如用农副产品或甲醇等作能源)。
用含有这种成分的分离培养基可筛选出能适应这种养分的菌种。
(2)菌的生长温度:
应选择高于40℃的菌种,这可大大降低大规模发酵冷却的成本。
因此用这一温度来分离培养高温生产菌在经济上是有利的。
(3)菌对所采用的设备和生产过程的适应性-适应性好
(4)菌的稳定性-稳定性高
(5)产物得率和产物在培养液中得浓度。
(6)产物是否容易从培养液中回收
(3)-(6)是用来衡量分离得到得菌种得生产性能,如能满足以上几条便有希望成为效益高得生产菌种。
但对筛选出得高效菌种在投入生产之前必须对其产物得毒性和菌种得生产性能作出评价。
14什么是富集培养?
是指能增加混合菌群中所需菌株数量得一种方法,其要领是提供一些有利与所需菌株生长或不利与其它菌型生长条件。
15富集培养的主要方法:
即()(摇瓶培养)和()(连续培养)。
分批式富集培养;
恒化式富集培养
16什么是分批式富集培养?
是将富集培养物转移到新的同一种培养基中,重新建立选择性压力,如此重复转种几次后,再取此富集培养物接种到固体培养基上以获得遗传背景一致的单菌落。
这种富集培养方法中,转种的时间最为关键,必须在所需菌种占优势的时候转接。
17什么是恒化式富集培养(连续培养)?
是通过改变限制性基质的浓度,来控制两类不同菌株的比生长速率μ,当基质浓度低于y时,菌株B将维持比菌株A高的比生长速率;
而基质浓度高于y时,菌株A有比菌株B高的比生长速率,因此可以通过改变稀释速率进行连续富集培养,获得所需菌种。
18优良的生产菌种应具备哪些基本特性?
(1)高产生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。
高产菌株的应用,可以在不增加投入成本的情况下,大幅度提高企业的产生能力。
(2)产物纯度高在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产品或其他产物。
这样不仅能提高营养物质的有效转化率,同时也减少了分离纯化的难度,降低成本,提高产品的质量。
(3)生长繁殖能力强、生长速率快产生孢子的菌种具有较强的产孢能力。
这样有利与缩短发酵周期,减少种子罐的级数,最终减少设备投资和运转费用。
同时,还可以减少在扩大生产过程中发生菌种生产性能下降或杂菌污染的可能性。
(4)高转化率能够高效地将原料转化为产品,降低生产成本。
(5)可以利用广泛来源原材料,并且菌种对发酵原料成分的波动敏感性小。
(6)对需要添加的前体物质有耐受能力,不会将这些前体物质作为一般的碳源来利用。
(7)发酵过程中产生的泡沫要少,这对提高装料系数、单罐产量,降低成本有重要意义。
(8)具有抗噬菌体感染的能力强.
(9)遗传特性稳定保证发酵过程能够长期、稳定地进行,同时有利于使用最佳的工艺控制。
19选择育种方法时综合考虑的因素有哪些?
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验);
(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度;
(3)经济费用。
如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少,则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术:
如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识,则可选择基因重组等手段进行定向育种。
20简述工业菌种改良的方法。
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤:
通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量;
在代谢途径中引伸出新的代谢步骤,由此提供一个旁路代谢途径。
(2)增加前体物的浓度。
(3)改变代谢途径,减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
(4)抑制或消除产品分解酶。
(5)改进菌种外泌产品的能力。
(6)消除代谢产品的反馈抑制。
如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
21简述诱变育种的步骤。
1、出发菌株的选择
2、处理菌悬液的制备
3、诱变处理
4、中间培养
5、分离和筛选
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22诱变出发菌株要求:
要有一定的(),还应具有()、()、()、(),这样变异幅度才会大。
目标产物生产能力;
生长繁殖快;
营养要求低;
产孢子多且早;
对诱变剂敏感
23选好出发菌株应注意的事项是什么?
1.选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作出发株。
2.最好选择已经过生产选育的自发突变菌株
3.采用具有有利性状(如生长速度快、营养要求低,产孢子早而多)的菌株作为亲本。
4.由于有些菌株在发生某一变异后会对其他诱变因素的敏感性提高,因此有时可考虑选择已发生其它变异的居住作为出发株。
5.在选择核苷酸或氨基酸的出发菌株时,最好考虑至少能积累少量所需产品或其前体的菌株。
6.在选择抗生素出发菌株时,最好选择已通过几次诱变,并发现每次诱变后效价豆有一定程度提高的菌株作为出发菌株。
24在诱变育种中为什么要采用应单细胞(或单孢子)?
如何制备它们悬浮液?
诱变处理一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子进行,这是因为一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂,另一方面又可以避免长出不纯的菌落。
处理前应尽可能达到同步生长状态。
具体方法:
将细菌培养液以3000r/min离心5min,倾去上清液,将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
处理的细胞悬浮液要经过玻璃珠振荡打散,并用脱脂棉或滤纸过滤,以形成单细胞状态,一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个/ml左右。
霉菌诱变处理应采用孢子悬浮液,也应经打散和过滤成单孢子状态;
单孢子悬液制备方法:
取斜面,加入6ml0.1mol/LpH6.0的磷酸缓冲液,用接种环刮下孢子,振荡试管,立即通过带滤纸漏斗过滤,由此制得单孢子悬液,若孢子液浑浊状,其孢子浓度可达106个/ml。
25什么是同步培养法?
培养细胞达到生理活性一致的方法,称为同步培养法。
可以通过调整生理条件和用机械或物理手段分离细胞的方法,使细胞生长同步。
26什么是基本培养基?
能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)。
27什么是完全培养基?
能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM),如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。
28营养缺陷型的用途:
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。
目前生产()、()的菌种都是各种类型的缺陷型。
要研究(),()都必须有营养缺陷型的菌株为材料。
氨基酸;
核苷酸;
代谢途径;
育种技术
29检出缺陷型方法:
()、()、()。
影印法;
点种法;
夹层法
30简述开发新的代谢产物的途径。
(1)从自然界分离新的微生物菌株,或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。
(2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。
(3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。
(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。
(5)DNA重组技术。
31理想的菌种保藏方法应具备的条件有哪些?
(1)经长期保藏后菌种存活健在;
(2)保证高产突变株不改变表型和基因型,特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。
(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
32微生物菌种保藏的主要方法有哪些?
一、斜面保藏法--短期的保藏方法
二、液体石蜡保藏法--斜面保藏法的一种改进
三、沙土管干燥保藏法
四、真空冷冻干燥保藏法
五、液氮保藏法
六、悬液保藏法
33种子培养基有哪些特点?
(1)必须有较完全和丰富的营养物质,特别需要充足的氮源和生长因子。
(2)种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。
供孢子发芽生长用的种子培养基,可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。
(3)种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
34发酵培养基的特点是什么?
(1)根据发酵的产物合成的特点来设计培养基
对菌体生长与产物相偶联的发酵类型,充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。
对于生产氨基酸等含氮的化合物时,它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外,还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。
(2)发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些,这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率,增加经济效益。
(3)发酵培养基需耗用大量原料,因此,原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。
35发酵培养基的选择有哪些要求?
(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。
(2)有利于减少培养基原料的单耗,即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。
(3)有利于提高培养基和产物的浓度,以提高单位容积发酵罐的生产能力。
(4)有利于提高产物的合成速度,缩短发酵周期。
(5)尽量减少副产物的形成,便于产物的分离纯化。
(6)原料价格低廉,质量稳定,取材容易。
(7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响,利于提高氧的利用率,降低能耗。
(8)有利于产品的分离纯化,并尽可能减少产生“三废”的物质。
36简述发酵培养基的设计和注意事项。
1.提供必要的营养成分:
培养基成分必须满足细胞生长,代谢活动和合成产物所需的基本要求。
2.配制合适的浓度:
可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。
3.主成分与其他成分的配比。
4.控制合适的pH:
微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要—定的pH环境,在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。
因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。
37简述培养基中pH的具体控制方法。
1.可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH,但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分,使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。
2.还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况。
3.控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物,如以磷酸盐作为磷的成分;
或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。
4.避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀
葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。
这种物质不被微生物利用。
因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。
硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙,因此二者也不宜直接配成培养基。
38发酵工程中杂菌污染会造成怎样的不良后果?
(1)由于杂菌的存在,消耗基质或产物,造成生产能力下降;
(2)杂菌产生的一些代谢产物,改变发酵液的某些物化性质,造成产物提取更困难,从而回收率下降或产品质量下降;
(3)杂菌造成产物分解,导致生产失败;
(4)杂菌的大量繁殖,改变反应介质的pH,从而使生化反应发生异常变化;
(5)噬菌体污染造成菌体裂解,导致生产失败。
39严格纯种培养应采取哪些必要的措施?
1.使用的培养基和设备须灭菌;
2.好气培养过程中使用的空气应经过除菌处理;
3.设备应严密,生物反应器中要维持高于环境的压力;
4.培养过程中加入的物料须灭菌;
5.使用无污染的纯种。
40常用的灭菌方法有()、()、()、()、()。
化学灭菌;
辐射灭菌;
干热灭菌;
湿热灭菌;
过滤除菌
41什么是致死时间和致死温度,两者间有什么关系?
致死温度:
杀死微生物的极限温度。
致死时间:
在致死温度下,杀死,全部微生物所需要的时间。
二者相互关联:
在致死温度以上,温度越高,致死时间越短。
42热阻
微生物在某一特定条件下(主要是温度)的致死时间,可以用来表示微生物对热的抵抗能力。
43相对热阻
某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间。
44分批灭菌的定义及优缺点是什么?
分批灭菌(实罐灭菌)定义:
将自己制好的培养基放在发酵罐中,直接通入蒸汽进行加热,在达到灭菌要求的温度和压力后维持一定的时间,再冷却到发酵要求温度的工艺过程。
优点:
不需要附属的设备,操作简单。
缺点:
加热和冷却的时间长,营养物质容易损失;
发酵罐的利用率低;
不能采用高温快速灭菌的工艺。
45分批灭菌的要求有哪些?
要确保分批灭菌的成功必须有:
1、内部结构合理(主要无死角),焊缝及轴封装置可靠,蛇管无穿孔现象的发酵罐。
2、压力稳定的蒸汽。
3、合理的操作方法。
46简述分批灭菌的操作要点。
三路进汽:
直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热,直到所规定的温度,并维持一定的时间。
这就是所谓的“三路进气”。
四路出汽:
液面以上的管道口则应排放蒸汽,即蒸汽从排汽、接种、进料和消泡管排汽,这就是所谓的“四路出汽”。
47简述连续灭菌的定义及优缺点?
连续灭菌定义:
培养基在罐外经过一套灭菌设备的连续加热灭菌(短时间20-30’内使培养基达到灭菌温度130-140℃,维持5-15分钟),冷却再送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。
可以采用高温快速的灭菌工艺,物料受热时间短,减少营养成分的破坏,有利于提高得率;
发酵罐非生产占用时间少,容积利用率高;
均衡使用蒸汽,热能利用合理,减少锅炉负载不均现象;
适合自动化控制和降低劳动强度。
增加一套连续灭菌设备,增加了投资,同时增加操作环节;
不适用黏度大的培养基灭菌。
48密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养,进入发酵罐前空气必须进行()、()、()和()等处理。
冷却;
脱水;
脱油;
49空气除菌的方法有()、()、()、()。
辐射杀菌;
热杀菌;
静电除菌;
50发酵对空气和无菌程度的要求是什么?
发酵对无菌空气的要求是:
无菌,无灰尘,无杂质,无水,无油,正压等几项指标;
发酵对无菌空气的无菌程度要求是:
只要在发酵过程中不因无菌空气染菌,而造成损失即可。
51发酵过程出现杂菌污染应如何处理?
(1)种子罐染菌:
发现后不进行后面的移菌工作,及时采用高压蒸汽直接灭菌。
(2)发酵罐染菌
发酵前期:
杂菌对生产菌危害大,蒸汽灭菌后放掉;
杂菌对生产菌危害不大,直接灭菌后重新接菌;
杂菌量少且生长缓慢,则继续运转,但要注意杂菌的数量和代谢的变化。
发酵中后期:
加入适量的杀菌剂或抗生素抑制杂菌生长;
降低培养温度或控制补料抑制杂菌的生长;
考虑提前放罐。
(3)染菌后的设备处理
a.染菌后的罐体用甲醛等化学物质灭菌处理。
b.用蒸汽灭菌(包括各种附属设备)。
c.再次投料前,彻底清洗灭菌罐体和附件。
d.进行发酵罐严密性检查,防止渗漏。
52如何判断发酵过程的噬菌体污染?
1.发酵液突然变稀,泡沫增多;
2.早期镜检发现:
茵体染色不均匀,较短时间内茵体大量自溶,最后仅残留茵丝的断片;
3.平板培养出现典型的噬菌斑;
4.溶氧浓度回升提前,营养成分消耗少,产物合成停止等。
53简述发酵过程的噬菌体污染的处理方法。
1.发酵液高压蒸汽灭菌后放掉,防止发酵液的任意流失。
2.全部停产,对环境和设备进行全面的清洗消毒,杜绝噬菌体寄生的环境基础。
3.更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体的菌种,防止噬菌体的重复污染。
54酵罐的定义是什么?
是为一个特定生物化学过程的操作提供良好而满意的环境的容器。
55发酵工业上最常用的是()。
除了通风搅拌发酵罐外,其它型式的发酵罐如:
()、()、()等。
通风搅拌罐;
气提式发酵罐;
压力循环发酵罐;
带超滤膜的发酵罐
56典型发酵设备应包括什么?
种子制备设备
主发酵设备
辅助设备(无菌空气和培养基的制备)
发酵液预处理设备
粗产品的提取设备
产品精制与干燥设备
流出物回收,利用和处理设备
57密闭厌氧发酵罐的要求是:
()、()、()、()、消灭死角、()。
能封闭;
能承受一定压力;
有冷却设备;
罐内尽量减少装置;
便于清洗灭菌
58简述朝日罐及其特点。
前发酵和后发酵合一的室外大型发酵罐,朝日罐是用4—6mm的不绣钢板制成的斜底圆柱型发酵罐。
其高度与直径比为1:
1-2:
1,外部设有冷却夹套,冷却夹套包围罐身与罐底。
外面用泡沫塑料保温内部设有带转轴的可动排酒管,用来排出酒液,并有保持酒液中CO2含量均一的作用。
朝日罐特点,朝日罐与锥形罐具有相同的功能,但生产工艺不同。
(1)利用离心机回收酵母
(2)利用薄板换热器控制发酵温度
(3)利用循环泵把发酵液抽出又送回去。
59机械搅拌发酵罐的基本条件是什么?
(1)发酵罐应具有适宜的径高比。
罐身越高,氧的利用率较高。
(2)发酵罐能承受一定的压力。
(3)要保证发酵液必须的溶解氧。
(4)发酵罐应具有足够的冷却面积。
(5)发酵罐内应尽量减少死角,避免藏垢积污,灭菌能彻底,避免染菌。
(6)搅拌器的轴封应严密,防病量减少泄漏。
60简述机械搅拌发酵
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