黄酮类化合物的结构文档格式.docx

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　　②如有5，6，7-或5，7，8-三羟基或3′，4′-二羟基，则吸收带将随放置的延长而逐渐衰退。

　　③二氢黄酮、二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移的大小取决于是否有游离的5-OH。

　　2．乙醇钠

　　①乙醇钠使7-羟基异黄酮的带Ⅱ向红位移6～20nm，但6-位有含氧取代基时，乙醇钠几乎不能使带Ⅱ产生移动。

4′，5，6，7-四羟基异黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。

　　②乙醇钠使5，7-二羟基二氢黄酮和5，7-二羟基二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移34～37nm，而其相应的5-去氧化合物则移动51～58nm。

5，6，7-三羟基二氢黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。

3．乙醇钠/硼酸

　　不能用NaOAc/H3BO3对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类的紫外光谱的影响来检查B环邻位二羟基，因为它们的B环与主要发色团缺少有效的共轭。

但它们中的A环有6，7-二羟基时，加入NaOAc/H3BO3后使带Ⅱ向红位移10～15nm。

4．三氯化铝和三氯化铝/盐酸

　　①异黄酮、二氢黄酮（可能也包括二氢黄酮醇）的A环如有邻二羟基（6，7-或7，8-，不包括5，6-），则带Ⅱ在AlCl3中比在AlCl3/HCl中向红位移11～30nm。

　　②有5-羟基的异黄酮，其带Ⅱ在AlCl3/HCl存在下与在甲醇中的光谱相比，向红位移10～14nm，而有5-羟基的二氢黄酮和有5-羟基的二氢黄酮醇类的带Ⅱ在同样情况下向红位移20～26nm。

目标检测：

黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于谱学的综合解析，而化学方法和色谱方法已降至辅助地位。

未知黄酮类化合物的鉴定，多在测定分子式的基础上，利用PPC或TLC得到的Rf值或hRf值与文献比较或分析对比样品在甲醇溶液中及加入各种诊断试剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析。

同时，对于化合物的颜色反应，以及在提取分离过程中所表现的行为（如溶解度、酸或碱中的溶解情况、铅盐沉淀等）也应注意分析。

但这些方法均有一定局限性，并曾导致得出过一些错误结论。

质子核磁共振（1H—NMR）因为可定量测定H的个数，以及根据质子的化学位移和芳香氢核之间的自旋偶合所提供的信息（裂分数目及偶合常数大小），可确定黄酮母核上的取代模式。

近来由于仪器分辨率的不断改进，加以同核去偶、溶剂位移以及核磁共振技术的使用，1H－NMR谱的测定对分析天然黄酮类化合物的结构已经成为一种非常重要的手段。

但是正如以后谈到的那样，在黄酮类化合物的1H-NMR谱上，有时要想确切指认每个信号并不是一件容易的事情。

例如当黄酮类母核的A-环上只有一个芳香氢核时，要想与H-3信号区别，就是十分困难的问题。

解决这种问题，13C核磁共振（13C－NMR）技术有很大的优势。

加上各种取代基位移及苷化位移效应的发现，使得图谱的解析工作大大简化。

因此，13C-NMR技术在黄酮类化合物的结构鉴定中发挥着越来越重要的作用。

质谱（MS）技术，尤其场解析质谱（FD－MS）与快速原子轰击质谱（FAB－MS）及串联质谱（MS－MS）的出现与应用，使其成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段之一（质谱技术的优势是只需要微量的样品就可获得有关整个分子结构及其主要碎片结构的重要信息）。

实际工作中常常根据需要，灵活、综合运用上述方法和手段，并辅以必要的化学方法，以求结构鉴定获得满意的结果。

二、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用

纸色谱（PPC）适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。

混合物的鉴定常采用双向色谱法。

以黄酮苷类来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如n-BuOH－HOAc－H2O（4∶1∶5上层，BAW）、t-BuOH－HOAC－H2O（3∶1∶1，TBA）或水饱和的n-BuOH等，这些主要是根据分配作用原理进行分离。

第二向展开溶剂则用水或下列水溶液，如：

2％～6％HOAc、3％NaCl及HOAc-浓HCl－H2O（30∶3∶10）等。

它们主要是根据吸附作用原理进行分离。

黄酮类化合物苷元一般宜用醇性溶剂或用C6H6－HOAc－H2O（125∶72∶3）、CHCl3－HOAC－H2O（13∶6∶l）、PhOH-H2O（4∶1）或HOAC一浓HCl-H2O（30∶3∶3）进行分离。

而花色苷及花色苷苷元，则可用含HCl或HOAC的溶液作为展开剂。

多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。

此外还可喷以2％AlCl3（甲醇）溶液（在紫外光灯下检查）或1％FeC13－1％K3Fe（CN）6（1∶1）水溶液等显色剂。

黄酮类化合物苷元中，平面性分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水类溶剂如3％～5％HOAC展开时，几乎停留在原点不动（Rf＜0.02＝；

而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf值较大（0.10～0.30）。

黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：

苷元＞单糖苷＞双糖苷。

以在BAW中展开为例，多数类型苷元（花色苷元例外）Rf值在0.70以上，而苷则小于0.70。

但在用水或2％～8％HOAC，3％NaCl或1％HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。

另外，糖的结合位置对Rf值也有重要的影响。

不同类型黄酮类化合物在双向PPC展开时常常出现在特定的区域，因此可推测它们的结构类型以及判定是否成苷以及含糖数量。

除PPC外，TLC用于黄酮类化合物的鉴定也日趋广泛。

一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂有硅胶与聚酸胺，其次是纤维素。

硅胶薄层色谱；

用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物较好。

分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5∶4∶1），并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。

另外尚有苯-甲醇（95：

5）、苯-甲醇-醋酸（35∶5∶5）、氯仿一甲醇（8.5∶1.5∶7∶0.5）、甲苯-氯仿-丙酮（4O∶25∶35）、丁醇一吡啶-甲酸（40∶10：

∶）等分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或醋酸乙酯等中性成分，可用苯-丙酮（9∶1）、苯-醋酸乙酯（7.5∶2.5）等为展开剂。

聚酸胺薄层色谱：

适用范围较广，特别适合于分离合游离酚羟基的黄酮及其苷类。

由于聚酸胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要可以破坏其氢键缔合的溶剂为展开剂。

在大多数展开剂中含有醇、酸或水。

常用的展开剂有乙醇一水（3∶2）、水-乙醇-乙酸丙酮（4∶2∶1）、水-乙醇-甲酸-乙酸丙酮（5∶1.5∶l：

0.5）、水饱和的正丁醇一醋酸（100∶1∶100∶2）、丙酮-水（1∶1）、丙酮-95％乙醇-水（2∶1∶2）、95％乙醇-醋酸（100∶2）、苯-甲醇-丁酮（60∶20∶20）等。

Stahl总结前人的工作，介绍了一些黄酮苷元和黄酮苷用硅胶、聚酸胺与纤维素三种薄层色谱和四种混合溶剂作为展开剂所得到的hRf值。

三、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用

紫外及可见分光光度法是鉴别黄酮类化合物结构的一种重要手段，一般程序如下：

（1）测定样品在甲醇溶液中的UV光谱；

（2）测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。

常用的诊断试剂有甲醇钠（NaOMe）．醋酸钠（NaOAc）、醋酸钠一硼酸（NaOAc－H3BO3）．三氯化铝（AICI3）及三氯化铝一盐酸（AICI3－HCI）等。

提取与分离

一、提取

黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。

黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。

其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。

一些多糖苷类则可以用沸水提取。

在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（如0.1％盐酸）。

但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。

为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。

大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元，可用苯进行提取。

对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有：

（一）溶剂萃取法：

利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。

例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。

而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。

有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。

常用的溶剂系统有：

水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。

溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。

（二）碱提取酸沉淀法

黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。

此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。

现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。

槐米（槐树SOphorajaponicaL．花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8～9，在此pH条件下微沸20～30min，趁热抽滤，残渣再加4倍量的水煎一次，趁热抽滤。

合并滤液，在60～70t的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至PH为5，搅匀后静置24h，抽滤。

用水将沉淀物洗至中性，60℃干燥得芦丁粗品，用沸水重结晶，70一80℃干燥后得芦丁纯品。

在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过离，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。

在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。

当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出。

这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。

（三）炭粉吸附法

主要适于苷类的精制工作。

通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。

过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、佛甲醇、7％酚一水、15％酚一醇溶液进行洗脱。

对各部分洗脱液进行定性检查（或用PPC鉴定）。

通过对BaPtisialecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用7％酚一水洗下。

洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。

二、分离

现将较常用的分离方法介绍如下：

（一）柱色谱法

分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。

此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。

1．硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。

少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。

供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。

2．聚酰胺柱色谱　对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。

其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。

聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。

以Baptisialecontei为例：

黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：

（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：

叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。

（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。

当分子中羟基数目相同时，羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：

具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。

（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：

异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。

（4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。

上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。

3．葡聚糖凝胶（Sephadexgel）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：

Sephadex－G型及Sephadex－LH－厂－型。

用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是：

分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。

凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。

但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。

在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。

表6-5中Ve为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积；

V0为柱子的空体积。

Ve／V0数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。

上表所列数据清楚地表明：

苷元的羟基数越多，Ve／V0越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则Ve／V0越小，越容易洗脱。

葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：

（1）碱性水溶液（如0．1mol／LNH4OH），含盐水溶液（0．5mol／LNaCI等）。

（2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇－水（不同比例），叔丁醇－甲醇（3：

1）、乙醇等。

（3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇－氯仿等。

（二）铅盐法

此法过去曾用于研究，目前已很少采用。

一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。

（三）硼酸铬合法

有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。

（四）pH梯度萃取法

pH梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5％NaHCO3（萃取出7，4′－二羟基黄酮）、5％Na2CO3（萃取出7－或4′－羟基黄酮）、0.2％NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮）、4％NaOH（萃取出5－羟基黄酮）萃取而使之分离。

聚酰胺薄膜的分离机制主要是分子键氢键和吸附。

当展开剂为不同比例的醇-水时，其分离机制与反相板类似，苷元较苷的Rf值低；

当展开剂为有机溶剂时，分离机制与正相板类似，苷元较苷的Rf值高。

常用显色剂多了去了，看你是要用于鉴别什么了。

碘蒸气是通用显色剂，对很多化合物都显黄棕色。

碘显色过程中由碘蒸气分子与化合物发生结合而显色。

香草醛浓硫酸显色原理是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色。

比如：

（1）矾酸铵一浓硫酸溶液（Mandelin试剂）为1％矾酸铵的浓硫酸溶液。

如遇阿托品显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。

（2）钼酸铵一浓硫酸溶液（Frohde试剂）为1％钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。

（3）甲醛一浓硫酸试剂（Marquis试剂）为30％甲醛溶液0.2ml与10ml浓硫酸的混合溶液。

如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。

（4）浓硫酸如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。

（5）浓硝酸如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。

（1）重络酸钾-硫酸:

检查一般有机物.

喷洒剂:

5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中.

薄层检查:

喷洒后加热到150℃至班点出现

（2）荧光素-溴:

检查不饱和化合物

0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中

溴试剂:

5%的溴的四氯化碳溶液

喷洒后处理:

喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检查荧光,荧光素与溴化和成曙红（Eosin）（无萤光）,而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;

若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.

（3）碘:

方法:

a层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合物呈棕色斑点。

B层析谱放碘蒸气中5分钟（或喷5％碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷1％淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。

（4）硫酸：

通用

喷洒剂：

5％的浓硫酸乙醇溶液，或15％浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸－醋酸（1：

1）喷洒后处理：

空气中干燥15分钟，再热至110℃直至出现颜色或荧光。

（5）硝酸银－氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：

检查还原性物质。

溶液I:

0.1%N硝酸银;

溶液II:

5N氢氧化铵

I和II以1:

5混合（临用前混合）

105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现.

（6）磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:

检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体

5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液

120℃加热至斑点出现.

沉淀试剂:

1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性.

生物碱

（7）硫酸?

?

=硫酸:

检查生物碱及含碘化合物

0.1克硫酸?

混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入浓硫酸至澄清.

110℃加热数分钟至斑点出现.

（8）碘化铋钾（Dragendorff）试剂:

检查生物碱及其他含氟化合物.

溶液I:

0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中

溶剂II:

8克碘化钾溶于20毫升水中.

制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂用.

喷洒液:

制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得

（9）.碘化汞钾（Mayer）试剂:

检查生物碱.

制备液:

13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水稀释至1000毫升.

制备液加1/10体积的17%盐酸.

观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.

（10）?

酸纳-浓硫酸（Mandelin）试剂:

检查生物碱.

1%>

酸纳的浓硫酸溶液.与多种生物碱呈不同颜色.

（11）碘－碘化钾（Wagner）试剂:

1克碘及10克碘化钾,溶于50毫升水中,加热,加2毫升醋酸,再用水稀释至100毫升.

可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.

酚类,鞣质

（12）三氯化铁:

检查酚类及?

酸.

1~5%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液.并加盐酸少许.?

酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.

（13）铁氰化钾-三氯化钾:

检查酚类,芳香胺类及还原性物质.

1%铁氰化钾水溶液,2%三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.

喷洒后酚性物质呈蓝色斑点.再喷2N盐酸,能使颜色加深,纸谱可用烯盐酸洗去喷洒液.

（14）4-胺基安替比林-铁氰化钾（Emerson反应）:

检查酚类.

I.2%4-氨基安替比林乙醇溶液;

II.8%铁氰化钾水溶液.

或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液

先喷洒I,再喷洒II,即显色,或再放入密闭缸中,缸内放25%氢氧化铵,即产生橙色至深红色.

（15）对氨基苯磺酸,重氮盐（Pauly试剂）:

检查酚类,芳香胺类及能偶合的杂环化合物.

4.5克对氨基苯磺酸,加热溶于45毫升12N盐酸中,用水稀释至500毫升,取10毫升稀释液用冰冷却,加10毫升冷4.5%亚硝酸钠水溶液,0℃放15分钟（此试剂于0℃可保存3天）,用前加等体积1%碳酸钠水溶液.

一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.

（16）对甲苯磺酸:

检查甾体,黄酮,鞣质.

20%对甲苯磺酸氯仿溶液.

100℃加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.

含氧杂环及蒽醌类*

（17）三氯化铝:

检查黄酮体.

喷洒1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光

（18）碱式醋酸铅:

饱和碱式醋酸铅（或饱和醋酸铅）水溶液.

于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.

（19）醋酸镁:

检查蒽醌甙,甙元及黄酮体

0.5%醋酸镁甲醇溶液

90℃加热5分钟,呈红色至紫色斑点.

（20）氢氧化钾:

检查香豆素,蒽醌甙及甙元

5~10%氢氧化钾的甲醇溶液.

于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点.

萜类,甾体

（21）三氯化锑（Carr-Price试剂）:

检查甾体,萜类,皂类.

25克三氯化锑溶于75克氯仿中（亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液）.

100℃加热5分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.

（22）五氯化