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3.2.3Q96品种水稻在两个时期中SPS酶活性的变化8
3.3氮肥水平对水稻叶片蔗糖含量的影响8
3.4相关分析9
3.4.1氮肥与两个时期Q96水稻RuBP酶活性9
3.4.2氮肥与两个时期Q96水稻SPS酶活性9
4.结论与讨论10
4.1结论10
4.2讨论10
4.2.1氮肥与RuBP羧化酶活性10
4.2.2氮肥与SPS活性11
4.2.3氮肥与蔗糖含量11
致谢12
参考文献13
英文摘要14
氮肥对水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响
作者:
知临指导老师:
高俊山
(农业大学生命科学学院09生物科学1班,,230036)
摘要:
在农作物的生长发育过程中,氮肥是重要的因素之一,过度施氮或施氮不足都会影响农作物的代谢中的关键酶活性,最终会影响农作物的产量。
水稻是重要的粮食作物,氮肥施用量影响其光合作用及光合产物的运输,进而影响水稻的产量和品质。
本实验重点研究了氮肥对水稻中RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响,从而探索氮肥对水稻生长的最适水平。
结果表明,不同施氮条件下水稻叶片RuBP酶活性都是开花期最高,到成熟期又呈下降趋势;
低施氮量与RuBP羧化酶活性呈显著正相关。
而SPS酶活性在开花期含量很高,到成熟期下降。
同时,低水平氮肥处理时SPS酶活性最低。
这些结果为水稻生育期中合理施用氮肥提供了理论基础。
关键字:
水稻氮肥水平RuBP羧化酶SPS酶活性
1.前言
氮是核酸和氨基酸的必要组成成分之一,在植物生化进程中,叶片的光合作用是对氮供给最敏感的代谢反应之一。
氮缺乏或过量都会导致叶绿素含量、同化力合成、酶含量和酶活性的下降[1],并进一步导致植物叶面积降低和光合同化物的减少及加速生殖生长进程[2]。
可溶性蛋白氮(如RuBP羧化酶)在大多数C3植物中的含量大约是植物叶片蛋白质的一半以上,在C4植物的含量约是植物叶片蛋白质的1/4[3]。
RuBP羧化酶催化C3植物的碳同化过程中RuBP的羧化反应。
蔗糖是植物重要的光合产物,是植物体同化物运输的主要形式。
蔗糖磷酸合成酶(SPS)是植物体催化蔗糖合成的一种酶。
Harbron等(1981)曾指出蔗糖磷酸合成酶有可能是蔗糖合成途径中的一个重要的控制点,它的活性反映了蔗糖生物合成途径的能力。
Doehlert和Huber(1983)对大豆研究均表明,蔗糖磷酸合成酶(SPS)是影响大豆叶片中蔗糖合成的关键酶,而永庚等(2001)也发现磷酸蔗糖合成酶在小麦旗叶光合产物向蔗糖的转化过程中起关键性调节作用。
1.1Rubisco的功能及活性调节
Rubisco能催化双重反应即:
(1)羧化反应,形成二分子3-磷酸甘油酸的1,5二磷酸核酮糖(RuBP)的羧化作用;
(2)加氧反应,形成磷酸乙醇酸和3-磷酸甘油酸各一分子的RuBP的加氧作用,而继续形成的乙醇酸是光呼吸的底物。
已经表明O2是羧化反应的竞争性抑制剂,而CO2是加氧反应的竞争性抑制剂,且这两个反应的相对速度取决于CO2和O2的相对浓度,低的[CO2]/[O2]比值可以促进加氧反应,而高的[CO2]/[O2]比值则可以促进羧化反应,在正常空气中([O2]为21%,[CO2]为0.03%),C3植物中大约有30%向加氧反应进行,而70%则向羧化反应进行。
另外温度和pH值也影响这两种反应的相对速度。
[4-6]
关于RuBP羧化酶在体活化的调节,有实验证明不仅环境因素如温度、湿度、CO2浓度、光强等因素(尤其是光强,因为光照可活化此酶)对其活性有调节作用,而且在植物体pH值、CO2、Mg2+浓度、ATP/ADP比值等这些生理因子也会影响其活性。
最近几年来已发现植物体存在一种RuBP羧化酶的活化酶可催化Rubisco的氨基甲酰化作用,这种活化作用需要ATP,并且还证明了纯的活化酶还能催化ATP的水解。
与此同时,还发现植物体还存在一种RuBP羧化酶专一的源抑制剂,即2-羧-D-阿拉伯糖醇1-磷酸(CAIP),这种抑制剂在黑暗条件下在体的浓度增加,可与氨基甲酰化的酶相互结合。
光照条件下,这种抑制剂又和酶分离。
[7,8]
1.2SPS的酶学特性及在蔗糖代谢中的作用
该酶的最适pH值约7.0,UDP、UTP、ATP能明显地抑制其酶活,UTP是该酶UDPG的竞争性抑制剂,Mg2+对它有促进作用,G6P则无影响。
酶的两个底物F6P及UDPG的饱和动力学曲线分别为双曲线型和S型,Km(UDPG)=20.0mmol/L;
Km(F6P)=0.93mmol/L,Vm(UDPG)=333nmolSucmg-1proteinmin-1;
Vm(F6P)=83.3nmolSucmg-1proteinmin-1,Hill(F6P=l.0;
Hill(UDPG)=1.4。
水稻叶片蔗糖磷酸合成酶的活性受UTP、ATP、UDP、UDPG等因素的调节[9]。
蔗糖是高等植物光合作用的主要产物,是碳运输的主要形式,也是“库”代谢的主要基质。
蔗糖也是许多果实中糖积累的主要形式,是果实品质形成的重要因子。
此外,它还是细胞代谢的调节因子,可能通过影响基因表达发挥作用。
而SPS却在蔗糖代谢中起着重要的作用。
[10]
1.3本实验的目的和意义
1.3.1实验目的
本文选用不同氮肥处理下对两种水稻的培育,分别对其不同生育期的RuBP羧化酶和SPS酶活性进行了初步研究,从而揭示不同氮肥条件下RuBP羧化酶和SPS酶活性的变化规律,进而探讨RuBP羧化酶和SPS酶活性与水稻产量的关系。
1.3.2实验意义
本研究从氮肥对RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响入手,旨在探索水稻在不同氮肥条件下,生长发育过程中代谢反应中一些关键酶活性的变化以及一些产物含量的变化,从而找到最适合水稻生长发育的氮肥水平,进一步提高水稻产量和质量,避免氮肥的浪费,保护土壤环境。
2.实验材料与方法
2.1实验材料
实验所选材料来自于省农业科学研究院水稻研究所培育的水稻品种,选取不同氮素水平处理下Q96和Q114两个叶片品种,分别采取不同发育时期的水稻叶片,经液氮处理后保存备用。
氮水平处理方式如下:
A无氮处理为不施氮肥;
B低氮处理为基肥0.416g/盆;
蘖肥0.312g/盆;
穗肥0.312g/盆;
C中氮处理为基肥1.240g/盆;
蘖肥0.930g/盆;
穗肥0.930g/盆;
D高氮处理为基肥1.656g/盆;
蘖肥1.224g/盆;
穗肥1.224g/盆。
2.2实验试剂及仪器设备
2.2.1主要试剂
DTT,NADH·
Na2,6-磷酸果糖,牛血清蛋白(Solarbio公司产品),ATP,1,5-二磷酸核酮糖,3-磷酸甘油酸激酶,3-磷酸甘油醛脱氢酶,UDPG(SIGMA公司产品),乙二醇,乙醇(95%),36%盐酸,甘油,无水乙酸镁,间苯二酚,蔗糖,Tris,MgCl2·
6H2O,乙二胺四乙酸二钠,聚乙烯吡咯烷酮(PVP),碳酸氢钠,氢氧化钠。
2.2.2主要仪器
LK-S3D型三温三控水浴锅(中仪国科(北京)科技),电子分析天平(奥豪斯国际贸易(上海)),3K30台式高速冷冻离心机(SIGMA公司),日立U-2900双光束分光光度计(HitachiHigh-TechnologiesCorporationTokyoJapan)。
2.3实验方法
2.3.1RuBP羧化酶活性的测定
2.3.1.1实验原理
RuBP羧化酶催化RuBP与一份子CO2结合,产生两分子PGA,PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下,产生3-磷酸甘油醛,并使还原型辅酶I(NADH)氧化,反应如下:
RuBP+CO2+H2O----2PGA
3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP
1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+-------3-磷酸甘油醛+NAD+
通过上述偶联反应,可将3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定,因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。
2.3.1.2试验步骤
1.酶提取
取新鲜水稻叶片0.125g,洗净擦干,充分研磨,加入10mL预冷酶提取液,高速研磨30s,进行3次,匀浆4层纱布过滤,滤液20000r/min离心15min(2-4oC),弃沉淀,上清液即为酶提液,0oC保存备用。
2.酶活测定
取干净试管,依次加入蒸馏水0.8mL,Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、MgCl2、ATP、DTT、NADH、EDTA各0.3mL,KHCO3和已纯化的RuBP酶各0.1mL,于30oC下保温10min,然后加入3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶混合液0.1mL,在340nm处测定其OD值,以此为零点,最后加入RuBP溶液0.1mL,立即在349nm处每隔30s测一次OD值,持续1min,记录数据。
3.结果计算
RuBP羧化酶活力[mmolCO2/(min*mL)酶液]=(E0-E1)*Vt/(2*d*ξ*Δt*Vs)
式中,E0、E1分别为反应前后反应液的A340;
Δt为E0到E1的时间(min);
ξ为1μmolNADH的吸光系数(6.22);
d为比色杯的光径(cm);
V为酶液总量(ml);
Vs为反应液体积(mL);
2为每固定1molCO2有2molNADH被氧化;
并把1mmolCO2/(min*mL)酶活力单位规定为1U。
2.3.2SPS酶活性的测定
2.3.2.1实验原理
蔗糖磷酸合成酶可催化UDPG与果糖-6-磷酸(F6P)结合形成磷酸蔗糖:
UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+
6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶(SPP)水解后形成蔗糖。
实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体形成一个复合体,因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。
酶活性测定是外加UDPG和F6P,测定产物蔗糖的量表示酶活性。
一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径,而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。
果糖是酮糖,可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物,在一定围糖的含量与反应液颜色成正比。
蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖,也能生成红色产物,在480nm处可比色测定。
2.3.2.2试验步骤
1.准备试剂
提取缓冲液:
100mmol/LTris-HCl,含5mmol/LMgCl2·
6H2O、2mmol/LEDTA、2%乙二醇、0.2%牛血清蛋白、5mmol/LDTT、2%PVP;
酶反应液:
100mmol/LTris-HCl,含10mmol/L6-磷酸果糖、2mmol/LEDTA、5mmol/L乙酸镁、5mmol/LDTT;
10mmol/LUDPG;
2mmol/LNaOH;
30%盐酸;
0.1%间苯二酚;
1mg/mL蔗糖标准液。
2.酶液制备
称取0.1g植物叶片,置于预冷的研钵中,分批加入5ml提取缓冲液,冰浴研磨提取,2度下10000转离心20分钟,取上清液备用。
3.酶活测定
取3支10ml具塞试管,加入0.4ml酶反应液,0.1mlUDPG和0.1ml透析后的酶液,补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后,沸水浴3min中止反应,对照用蒸馏水代替UDPG。
4.蔗糖含量测定
往各反应试管中加入2mol/LNaOH0.1mL,沸水浴10min,冷却至室温。
加30%HCl3.5mL,0.1%间苯二酚1mL,摇匀后于80oC保温10min,冷却后480nm处测定蔗糖生成量。
5.标准曲线制作
取7支10ml具塞试管,编号1到7,从1号管到7号管依次加入0、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的1mg/mL蔗糖标准液,之后各管补蒸馏水至1mL,按上述步骤3反应并测定其吸光度。
以吸光度值为纵坐标,蔗糖含量为横坐标,绘制标准曲线,以计算反应中蔗糖形成的数量。
6.结果计算
蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖/(g*min),定义1mg蔗糖/(g*min)酶活单位为1U。
酶活力(mg蔗糖/(g*min))=C*Vt*n/(FW*t*Vs)。
式中:
C是从标准曲线查得的蔗糖量(mg);
FW是样品鲜重(g);
t是反应时间(h);
Vt是提取酶液总体积(ml);
Vs是测定测定时取用酶液体积(ml);
n是提取液测定中的稀释倍数。
2.4数据处理
所有测定结果用EXCEL、DPS和LSD统计分析软件进行数据统计分析(p<
0.05)。
3.实验结果与分析
3.1不同氮肥水平对RuBP羧化酶活性的影响
3.1.1两个水稻品种开花期RuBP羧化酶活性的变化
分别取Q96和Q114两个品种在开花期的水稻叶片,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算成酶活,其结果如图3-1所示。
由图可知,低水平氮肥处理的水稻中RuBP羧化酶活性最高,无氮和中氮都会抑制酶活,且Q114品种在开花期叶片中的RuBP羧化酶活性在低氮和中氮水平下比Q96品种高。
图3-1两个水稻品种开花期RuBP羧化酶活性的变化
Fig.3-1ChangesofRuBPcarboxylaseactivitiesinblossomperiodoftworicevarieties
3.1.2两个水稻品种成熟期RuBP羧化酶活性的变化
分别取Q96和Q114两个品种在成熟期的水稻叶片,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算成酶活,其结果如图3-2所示。
由图可知,不同的施氮条件对RuBP羧化酶的影响不尽相同,其中低水平氮肥处理的水稻中RuBP羧化酶活性最高,无氮和中氮都会抑制酶活,且Q114品种中的RuBP羧化酶活性在成熟期比Q96品种高。
图3-2两个水稻品种成熟期RuBP羧化酶活性的变化
Fig.3-2ChangesofRuBPcarboxylaseactivitiesinmatureperiodoftworicevarieties
3.1.3Q114品种水稻在两个时期中RuBP酶活性的变化
分别取Q114品种开花期和成熟期的水稻叶片,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算成酶活,其结果如图3-3所示。
由图可知,低氮水平处理的样品在两个时期酶活均最高,低水平氮肥施用量有利于促进水稻叶中RuBP羧化酶的活性。
同时,开花期中无氮和低氮水平处理过的Q114水稻品种的RuBP羧化酶活性高于成熟期,而成熟期中用中氮和高氮水平处理的Q114水稻品种的RuBP羧化酶活性高于开花期。
图3-3氮肥水平对Q114品种在两个时期RuBP酶活性的影响
Fig.3-3EffectsofnitrogenfertilizerlevelsonRuBPcarboxylaseactivitiesintwoperiodsofQ114variety
3.2不同氮肥水平对水稻SPS酶活性的影响
3.2.1两个水稻品种开花期SPS酶活性的变化
分别取开花期的Q96和Q114两种品种叶片,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算出酶活。
由图3-4所示,可知在水稻开花期,适中程度的施氮水平能提高水稻中SPS酶活性,而低程度的氮肥水平下水稻中SPS酶活性较低,但Q96水稻品种中的SPS酶活性比Q114中的要高。
图3-4两个水稻品种开花期SPS酶活性的变化
Fig.3-4ChangesofSPSactivitiesinblossomperiodoftworicevarieties
3.2.2两个水稻品种成熟期SPS酶活性的变化
分别取成熟期的Q96和Q114两种水稻品种叶片,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算出酶活。
由图3-5所示,可知在水稻成熟期,适中程度的施氮水平能提高Q114水稻中SPS酶活性,但在任何氮肥水平下与Q96水稻中SPS酶活性都很低,且基本不变。
总体来看,Q114水稻品种中的SPS酶活性比Q96中的要高。
图3-5两个水稻品种成熟期SPS酶活性的变化
Fig.3-5ChangesofSPSactivitiesinmatureperiodoftworicevarieties
3.2.3Q96品种水稻在两个时期中SPS酶活性的变化
分别取水稻开花期和成熟期的Q96水稻品种样品,测定其在无氮、低氮、中氮和高氮水平下的吸光度值,换算出酶活,其结果如图3-6所示。
由图可知,Q96水稻品种在开花期需要中等程度的施氮,这时SPS酶活性最高,而在成熟期任何氮肥条件下SPS酶活性都很低,且水稻开花期中SPS酶活高于成熟期,这与Q114品种的结果一致。
图3-6氮肥水平对Q96品种两个时期SPS酶活性的影响
Fig.3-6EffectofnitrogenlevelsontheSPSactivitiesintwoperiodofQ96variety
3.3氮肥水平对水稻叶片蔗糖含量的影响
根据上述方法,以吸光度值为纵坐标,以蔗糖含量为横坐标绘制标准曲线如图3-1所示,得到回归方程为y=1.9369x。
由蔗糖含量标准曲线可知,蔗糖含量与SPS是正相关的,即SPS酶活性高,则相应的蔗糖含量也高。
图3-7蔗糖含量标准曲线
Fig.3-7StandardcurveofsucroseconcentrationagainstABS
3.4相关分析
3.4.1氮肥与两个时期Q96水稻RuBP酶活性
氮肥对Q96水稻在两个时期RuBP羧化酶活性的影响如表1,用DPS进行数据处理,处理间进行显著性差异分析,其中小写字母不同则代表处理间有显著差异。
由表1可知,在开花期,无氮和高氮处理没有显著差异,低氮处理和其他处理有显著差异,中氮与无氮、低氮和高氮有显著差异。
而在成熟期,无氮和中氮处理没有显著差异,与其他氮肥处理有显著差异,低氮处理和其他处理有显著差异,高氮与无氮、低氮和中氮有显著差异。
所以低氮水平处理Q96品种水稻最适合。
表1氮肥对两个时期Q96水稻RuBP羧化酶活性的影响
Table1EffectsofnitrogenfertilizeronRuBPcarboxylaseactivitiesintwoperiodofriceQ96
氮肥
开花期
成熟期
5%显著水平
1%显著水平
低
a
A
高
b
B
无
c
C
中
3.4.2氮肥与两个时期Q96水稻SPS酶活性
氮肥对Q96水稻在开花期SPS酶活的影响如表2,用DPS进行数据处理,处理间进行显著性差异分析,其中小写字母不同则代表处理间有显著差异。
由表2可知,在两个时期,四种氮肥处理均有显著差异。
表2氮肥对两个时期Q96水稻SPS酶活性的影响
Table2EffectsofnitrogenfertilizeronSPSenzymeactivitiesintwoperiodofriceQ96
d
D
4.结论与讨论
4.1结论
不同的氮肥条件对RuBP羧化酶的影响不尽相同,低水平氮肥处理的水稻中RuBP羧化酶活性最高,无氮和中氮都会抑制酶活,所以低水平氮肥施用量有利于促进水稻叶中RuBP羧化酶的活性。
且在开花期和成熟期的Q114品种中的RuBP羧化酶活性在低氮和中氮水平下比Q96品种高。
在水稻开花期,适中程度的施氮水平与水稻中SPS活性呈正相关,低程度的氮肥水平与水稻中SPS活性呈负相关,且Q96水稻品种中的SPS酶活比Q114中的要高。
在水稻成熟期,适中程度的施氮水平与水稻中SPS活性呈正相关,低程度的氮肥水平与水稻中SPS活性呈负相关,但Q114水稻品种中的SPS酶活比Q96中的要高。
在Q96水稻样品中,低氮水平则在水稻两个时期中与SPS酶活呈负相关,且水稻开花期中SPS酶活高于成熟期,这与Q114品种的结果一致。
4.2讨论
4.2.1氮肥与RuBP羧化酶活性
以往研究已经表明,随着施氮量的增加,地上部分生长逐渐旺盛,而过量施氮,则更加剧叶丛的形成,从而影响甜菜的生长发育[11]。
本实验表明,RuBP羧化酶活性随施氮量增加在各生育时期的表现有所不同。
开花期低施氮量与RuBP羧化酶活性呈显著正相关,其它各生育时期也呈正相关,但不显著。
在开花期氮素释放量较少,过量地施氮会刺激生长,而到了成熟期以后,过量地施氮会导致氮代谢的不协调,进而也影响到了CO2的同化,因此低氮处理开花期最高,而在成熟期后反而低与高氮处理。
且低氮处理自开花期期上升很快,一直优于其他处理,尤其在生育中后期保持较高的酶活性,为其高糖和高产高糖奠定基础。
从而说明低氮处理优于其它的处理。
4.2.2氮肥与SPS活性
已往有研究表明,开花后小麦旗叶的蔗糖含量以开花后7d最高,不同施氮时期旗叶叶片中蔗糖含量存在差异,表明追氮时期过早或过晚都会显著降低小麦开花之后旗叶的蔗糖含量[12]。
本实验结果与之一致,开花期SPS酶含量很高,到成熟期下降。
同时,均为低水平处理时SPS酶活最低。
SPS的活力大小直接影响光合产物在淀粉与蔗糖之间的分配,SPS活力越高,蔗糖积累得越多直接影响光合产物在淀粉与蔗糖之间的分配,SPS活力越高,蔗糖积累得越多[13]。
SPS作为合成蔗糖的主要酶之一,在水稻生长的前期要提供大量的蔗糖以供植株的生长发育,随着植株生长发育,SPS酶活表现为逐步增强,而到了后期,植株对蔗糖的需求量相对于生长时期有了一定程度的减少,故而此时SPS酶活增长缓慢或开始下降[14]。
4.2.3氮肥与蔗糖含量
已有研究认为春玉米穗位叶的蔗糖含量以吐丝后7d最高随灌浆进程的推进蔗糖含量下降,随氮素用量的增加穗位叶蔗糖含量有增加的趋势,但施氮量达到一定程
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