细胞生物学讲座期末复习Word下载.docx
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⑶圆形精子细胞(Spermatid)
由于在第二次减数分裂前没有进行DNA复制,所以圆形精子细胞中染色体数目减少一半,成为单倍体细胞。
精子细胞不再分裂,而是进入一个复杂有序的形态演变过程,形成具有头、颈、尾结构的精子,该过程为精子形成期。
(三)精子形成期:
1.细胞核的变化
细胞核内染色质浓缩、体积变小、偏向细胞一极,形成精子头部。
染色质的浓缩主要是由于染色质中的组蛋白(histone)被富含精氨酸的鱼精蛋白(protamine)取代。
这一碱性蛋白中大量的正电荷,吸引着带负电的DNA发生凝聚。
2.顶体(acrosome)的形成——是由高尔基复合体形成的。
精子细胞的高尔基复合体首先产生许多小液泡。
小液泡融合变大,形成一个大液泡,位于核的顶部,称为顶体。
内含多种水解酶,在穿卵过程中起着重要作用。
3.线粒体鞘的形成——来自于细胞的线粒体。
在精子形成过程中,精子细胞的线粒粒体变细伸长,迁移到中段,围绕着中央轴丝而形成螺旋状排列的线粒体鞘。
物种不同,线粒体鞘构型有很大差别。
而在哺乳类动物中则形成了典型的螺旋状排列的线粒体鞘。
是精子运动的“能源库”。
4.精子尾部的形成
中央轴丝是构成鞭毛型精子尾部的基本细胞器,其外周还有致密的纤维和纤维鞘,纤维鞘并不完全到达尾的末端。
包括颈部、中段、主段、末段。
5.细胞质的变化
精子细胞的大部分细胞质,在精子形成过程中成为残体(residualbody)而被抛弃。
当细胞核前端形成顶体时,细胞质向后方移动,仅留下一薄层细胞质与质膜覆盖在和细胞核上。
当尾部的后端生长时,细胞质的大部分附着在精子中段,当线粒体围绕着轴丝时,该处的细胞质和高尔基体成为残余胞质被抛弃,仅剩下一薄层细胞质包围着中段的线粒体。
二、发生的主要事件:
(1)二倍体精原细胞转化为单倍体精原细胞。
(2)细胞核浓缩,染色质核小体中的组蛋白被富含精氨酸的精蛋白替换
(3)形成顶体
(4)形成鞭毛
(5)线粒体缠绕中央轴丝形成线粒体鞘
三、调节精子发生的因素:
细胞间的调节、激素调节、基因调节
(一)细胞间的调节
细胞的功能:
1.Sertolicell(支持与营养作用):
形成:
血-睾屏障
合成:
雄激素结合蛋白
提供:
为生殖细胞提供营养
分泌:
睾丸液
2.Leydigcell(分泌功能):
被LH激活,分泌睾酮来调节精子发生。
生精细胞的不同阶段:
不同成熟阶段的生殖细胞之间:
包括生殖细胞与Sertolicell以及sertolicell之间,管周细胞和Leydigcell之间的联系。
(二)激素的调节
GnRH:
促性腺激素释放激素LH:
促黄体生成素FSH:
促卵泡生成素ABP:
雄激素结合蛋白(下丘脑—脑垂体---睾丸调节轴)
1.精原细胞:
FSH通过阻止凋亡来促进精原细胞的生成。
睾酮对这一步基本无影响。
2.精母细胞:
睾酮和FSH对这一步都有影响,尤其在阻止凋亡的过程中。
3.精子细胞:
除去FSH和LH诱导圆形精子细胞的凋亡;
除去睾酮导致圆形精子细胞和Sertoli细胞间失去粘连
4.精子排放:
FSH或睾酮的除去都可导致排放的精子数量减少(~15%),当两者都撤出时,半数精子不能排放。
(三)基因调节
调控基因:
精子发生特异基因、精子发生相关基
1.特异基因
三类特异基因:
⑴同源基因:
只在精原细胞中表达,但是与体细胞中的基因很近似。
通常是一类基因家族的成员。
⑵特异基因:
编码精原细胞特异的蛋白,与在其他细胞中表达的蛋白有显著不同。
⑶基因表达特异的转录产物:
表达精原细胞特异的转录产物,与这些基因在体细胞中转录的不同。
2.相关基因
在Sertoli,Leydig精原细胞中表达的基因:
(1)致癌基因
(2)减数分裂相关基因(3)细胞周期基因(4)细胞骨架(5)温度敏感基因
3.基因的表达调控
基因表达的内在调控主要在三个水平上进行:
转录,翻译,翻译后调控。
(1)和其他细胞一样,转录水平的调控是基因表达的首要决定因素。
(2)生殖细胞在翻译水平的调控比其他细胞更重要,特别是减数分裂后期的蛋白质合成。
精原细胞中特定的转录调节因子:
SPRM1,TAK-1,2FY-2,OCT-2,CREM
翻译水平:
a.选择性转录:
编码不同的亚型
b.mRNA结合蛋白:
储存mRNA
c.起始速率:
与核糖体有关
d.miRNA:
结合到靶基因上抑制转录
(3)翻译后调控主要是在精子发生过程中通过蛋白质的修饰来影响基因的转录和翻译来实现。
翻译后调节:
蛋白质的修饰、蛋白质的降解。
蛋白质的修饰:
甲基化/去甲基化,乙酰化/去乙酰化,磷酸化/去磷酸化。
可以改变染色质的结构,调节基因转录活性。
激活蛋白激酶,传递信号;
激活转录因子,调节基因表达。
a.泛素化途径:
泛素由76个aa的多肽链,泛素被泛素连接酶转移并结合于底物蛋白质,底物被泛素化,泛素化的蛋白质迅速降解。
b.自噬途径:
细胞内需要降解的成分(包括老化的细胞器及多余的蛋白)被溶酶体吞噬并降解。
精子发生的过程:
是一个特殊的细胞分化过程
原始的生精细胞——精原细胞——精母细胞——圆形精子细胞——长形精子细胞
精子发生过程中主要的事件:
双倍的精原细胞转化成单倍的精子细胞
核浓缩,染色体核小体的组蛋白被鱼精蛋白代替
顶体的形成
鞭毛的形成
线粒体缠绕中央轴丝形成线粒体鞘
研究基因表达的方法:
RT-PCR、NorthernBlot、RNase保护实验.
基因芯片:
同时可分析大量的基因表达
四、基因表达谱:
⑴基因的特异性表达
①我们体内大多细胞含有相同基因
②并不是所有基因在每一个细胞都表达
③当需要时一些基因才表达
④许多基因表达为某一类细胞所特有(如肝细胞表达解毒酶,胰细胞表达胰岛素)
⑤为了了解细胞是如何产生表达特异性的,要确定每类细胞的所表达的基因
⑵研究基因表达的方法
RT-PCR、NorthernBlot、RNase保护实验、基因芯片(同时可分析大量的基因表达)
⑶现在的研究状况:
运用微阵列技术来确定基因控制的精子发生。
膜芯片及玻璃芯片的特点:
a.膜芯片:
DNA结合牢固、点样量大、同位素标记(灵敏度高)、可重复使用、可自己分析,结果可靠,便宜,基因点数少。
b.玻璃芯片:
两组样品可在同一张芯片上杂交、基因点多,需特殊设备,由服务公司完成,可靠性较差,昂贵
五、生殖细胞:
1.是生命周期的一个关键环节。
2.发生减数分裂,形成单倍体细胞,保证了物种的遗传性。
3.DNA发生重组,后代产生变异,保持物种的多样性。
4.卵是机体最大的细胞,携带充足的原料。
5.精子通常最小,利用母本资源扩增父本基因,形体流线,运动能力较强,适应受精。
基因转移与RNA干扰
一、基因转移(genetransfer)
㈠基因转移是通过不同途径把外源基因转移到宿主细胞中,并在细胞中表达的过程。
其目的是研究基因的表达调控及其功能。
包括转染、转化、感染。
转染:
把外源基因转移到真核细胞中,主要指哺乳动物细胞。
转化:
把外源基因转移到原核细胞中的过程,指细菌中。
感染:
用病毒做载体进行的基因转移。
㈡基因转移两个主要因素:
受体细胞:
接受外源基因的细胞。
基因载体(运输工具):
携带目的基因并运送至细胞内。
□受体细胞应满足以下条件:
1.细胞本身并不表达要转染的基因,否则无法区分内源和外源基因。
2.基因的细胞特异性表达:
一些基因需要合适的细胞系才能表达,它们可以在一些细胞中被诱导表达,在另一些细胞中不能被诱导表达。
3.选择容易被转染的细胞:
容易培养、生长速度快的细胞容易被转染,成纤维细胞比上皮细胞容易被转染。
4.两种常用细胞系:
COS细胞:
用SV-40基因组转化猴的CV-1细胞
CHO细胞:
中国地鼠卵巢的成纤维细胞
□基因载体:
载体的功能:
1.为了外源基因的表达:
克隆的基因多数为cDNA,缺乏表达所必需的调控元件,需要重组到带有这些调控元件的载体上才能有效的表达。
2.为了更有效的进入细胞:
载体容易进入细胞。
理想的载体:
(1)可以高水平的表达目的基因
(2)可以高效的转移到细胞内
(3)具有高度的安全性(特别是基因治疗)
载体可以分为两大类:
病毒载体(viralvector);
非病毒载体(non-viralvector)
1、非病毒载体--质粒,是环状双链DNA,具有酶切位点,可分为:
a.非表达载体(克隆载体):
不含有表达元件,只用于基因的保存、扩增、序列分析
b.表达载体:
含有表达元件,分为真核细胞表达载体和原核细胞表达载体
质粒优点:
(1)安全性比较高,
(2)可整合到宿主基因组中,稳定表达。
缺点:
(1)转染效率低,<
50%
(2)随机整合,可能干扰宿主的基因。
2、病毒载体:
由于病毒的结构和生物学特性,如感染细胞、可把外源基因重组到病毒内,通过感染细胞把外源基因转到细胞内。
可分为逆转录病毒(RNA病毒)、腺病毒(DNA病毒)、腺相关病毒。
1)逆转录病毒:
优点:
(1)感染效率高,有时可高达100%
(2)可整合到宿主基因组中,稳定表达。
(1)只感染并整合到分裂细胞
(2)随机整合,可能干扰宿主的基因,从而引起疾病。
2)腺病毒:
(1)可以携带大量的外源基因,感染及表达效率高。
(2)基因不整合到属主细胞的基因组中,不会引起疾病,但只能瞬间表达。
(3)易受免疫系统的攻击。
3)腺相关病毒:
感染效率高;
携带的基因较少(4.5kb);
可以整合到基因组中。
㈢基因转移的方法:
以质粒为载体的基因转移方法:
1.DNA-磷酸钙沉淀法:
Ca2+、PO4-和DNA形成沉淀颗粒,可以沉附于细胞的表面,通过内吞作用摄取DNA。
适用于贴壁和悬浮培养的细胞。
转染效率低,小于10%。
影响转染效率的因素:
(1)沉淀颗粒的大小,由PH(7.05)控制
(2)沉淀中DNA的量,需高纯度的DNA(10-50μg)
(3)沉淀处理细胞的时间,6-24hr,因细胞不同而异
2.脂质体介导的基因转移:
原理:
脂质体+DNA→复合体,DNA被包围在复合体内,通过与细胞的融合或内吞进入细胞。
特点:
(1)转染效率高,可大于50%
(2)操作简便
(3)需要DNA量少,几微克
(4)脂质体对细胞有毒性
3.电转移:
细胞在短暂、高压地电脉冲的作用下,表面可形成微孔,改变细胞的通透性,DNA可直接进入细胞。
特点:
(1)效率高,适用于各种细胞
(2)操作简便、迅速
(3)严格控制条件—电压和时间
(4)需要特殊的设备—电转仪
(5)处理后约有20%-50%的细胞可以存活
4.微量注射:
直接把DNA注射到细胞质或细胞核中。
可有效的把基因注射到受精卵的原核中,制造转基因动物。
对于体细胞,可注射的数量有限;
不足于进行生化分析。
㈣基因在宿主细胞中的表达:
瞬间表达和稳定表达
瞬间表达:
外源DNA进入宿主细胞后,可在胞质中表达一段时间,随着细胞的分裂传代而丢失。
稳定表达:
只有在少数被转染的细胞中,外源基因整合到宿主基因组中并可遗传给后代,得以稳定表达,这类细胞称之为稳定转染细胞。
瞬间表达的检测:
瞬间表达的最佳时间:
为转染后48-72小时.24小时可以检测到,96小时表达下降.
瞬间表达检测方法:
1).检查RNA的表达:
用NorthernBlot,RT-PCR
(2)蛋白质的检测:
免疫荧光染色:
可以评估细胞的转染效率以及蛋白质在细胞中的定位.
WesternBlot:
可对蛋白进行定量研究
稳定表达细胞的筛选:
选择标记基因:
载体需要带有选择标记基因,
选择标记基因使得细胞在选择培养基
中生长.
选择标记基因的时间:
集落形成:
在选择浓度培养3-4周,挑出集落,
继续在选择培养基中培养1-2周,
可转入保持浓度培养基.
稳定转染的检测:
(1)用SouthernBlot证明外源DNA是否整合到宿主genome中,
(2)用NorthernBlot,RT-PCR检查基因的表达
(3)用免疫学方发检查蛋白质的产生
二、RNA干扰:
㈠RNA干扰是双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)引起的序列特异性的基因沉默。
转录后基因沉默。
当把一段与特定基因mRNA的序列相同的dsRNA导入细胞后,mRNA被dsRNA识别,并被降解。
是真核生物中一种普遍存在的基因调控机制。
㈡RNAi机制:
三步——起始、效应、放大
1.Initiationstep:
进入的dsRNA被消化为21-23个核苷的小干扰RNAs(siRNAs),也称为guideRNAs
2.Effectorstep:
siRNA双链结合到核酸酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RISC);
ATP依赖性的siRNAduplex解螺旋激活RISC;
活化的RISC通过碱基配对作用与同源转录物结合并从siRNA的3'
末端切掉mRNA~12个核苷。
3.Amplification:
通过复制进入的dsRNAs产生更多的siRNAs进行扩增;
也能在RdRP作用下通过siRNAs的复制扩增。
㈢RNAi需要的复合物
1、Dicer剪切酶
2、theRNA-inducedsilencingcomplex(RISC)RNA-诱导的沉默复合物
3、TheRNA-dependentRNApolymerase(RdRP)complex依赖于RNA的RNA聚合酶
(四)miRNA与siRNA
miRNA与siRNA的共同点
1.二者的长度都约在22nt左右。
2.都依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点。
3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。
4.都是RISC组分,所以其功能界限变得不清晰,如二者在介导沉默机制上有重叠。
5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。
miRNA与siRNA的区别
1.根本区别是miRNA是内源的,是生物体的固有成分;
而siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内。
2.结构上,miRNA是单链RNA,而siRNA是双链RNA。
3.Dicer酶对二者的加工过程不同,miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分降解;
而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
4.在作用位置上,miRNA主要作用于靶标基因3’-UTR区,而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
5.在作用方式上,miRNA可抑制靶标基因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。
6.miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达;
而siRNA不参与机体发育调节,是人为设计用于研究基因功能的工具。
㈤RNAi的应用:
BasicResearch、ClinicalPerspective
㈥RNAi的技术要点:
siRNA的设计;
siRNA的合成;
siRNA导入细胞的方法
赵方萄部分
细胞生物学研究技术与方法简介
掌握要点:
(小题:
填空、是非、选择)
1、光镜:
重要参数的意义,不同种类及应用
2、电镜:
常用种类、应用
3、常用的细胞分离方法及使用:
离心、流式、磁珠
4、离心机:
RCF、使用注意
5、共焦显微镜、流式细胞仪分别用于什么实验?
有什么区别?
6、做好流式实验的三个要求是什么?
7、了解各设备的应用目的
一、光镜:
参数:
1数值孔径(NA):
物镜框口能够纳进的光通量大小,NA越大,成像越清晰,镜头越好。
由于NA=n·
sina/2,其中物镜的框口孔径角无法改变,所以数值孔径只与介质折射率有关,与介质折射率成正比。
②分辨率:
分辨最短距离的两个质点的距离(d)。
与入射波长成正比,与数值孔径成反比。
③放大率、焦深、覆盖差、工作距离、视场直径等等。
A-PLAN:
矫正像差、色差能力;
光镜的不同种类及应用:
从工作原理分
从视觉效果分
几何光学显微镜
明场(BF)
暗场(DF)
物理光学显微镜
相差(PH)
微分干涉(DIC)
浮雕相衬(RC)
信息转换显微镜
荧光显微镜(FL)
【共聚焦显微镜】
1、几何光学显微镜:
明视野观察:
透射光显微镜,最常见,用于细胞组化看片、培养中细胞观察。
正置:
死细胞、染色;
倒置:
针对活细胞,细胞未染色。
暗视野观察:
入射光斜射,可通过被检物体的反射光或衍射光进行观察。
消除了强光直射时因强光绕射造成的人眼观察不到效果。
2、物理光学显微镜:
相差显微镜:
处理透过光,把肉眼不可见的光程差,变成肉眼可见的振幅差(明暗),从而看到活细胞内一些结构。
微分干涉/DIC:
处理入射光,通过特殊棱镜,使图像呈现三维立体效果。
针对活细胞、不染色,提高了标本细节折光率;
用于观察细胞的形态和运动。
3、信息转换显微镜:
分辨率高;
多信息同时标记;
定位定性定量
荧光显微镜-可以用于标记靶分子、限定入射光波长、提高分辨率、标记活细胞。
激光扫描共聚焦显微镜-照明点探测点共轭、光切片、共聚焦提高了分辨率。
用途:
a.形态学研究,b.分子生物学,c.活细胞动态荧光测量,d.直接对活组织或整体胚胎观察。
4、多光子显微镜:
照射光波长大于荧光染料吸收峰波长2倍,高能量(2KW)、超短脉冲(兆分之一秒)聚焦,使聚焦点瞬间产生高密度光子,出现双光子吸收激发荧光,双光子吸收仅发生在聚焦点,避免了焦点外激发而产生的漂白现象,高能量、超短脉冲聚焦、穿透性更强。
二、电镜:
常用种类、观察主要内容
1、扫描电镜:
利用“背散射电子”“二次电子”成像,用于观察细胞表面的结构。
扫描电子显微镜用来观察标本的表面结构。
常用的方法有一般扫描冷冻断裂和冷冻蚀刻,可以用来观察断面的表面结构。
2、透射电镜:
利用偏离原入射方向的“散射电子”、或者“衍射电子”成像。
目前TEM的分辨力可达0.2nm。
一般用于观察内部结构,常用的技术有超薄切片技术(用于观察亚细胞结构观察)和负染色技术(病毒、蛋白结构)
三、常用的细胞分离方法及使用:
流式、磁珠分选的特点
不同的细胞采用不同的分离方法:
①亚细胞群分离:
离心/流式/磁珠
②单个细胞分离:
显微激光切割术
③细胞器/可溶性大分子分离:
超速离心
(一)亚细胞群分离:
1、流式细胞仪:
是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,具有多参数分选、技术性强和相对消毒的特点,可以同时进行4色分选。
目的:
识别混合细胞中含有某些特性的亚细胞群。
用荧光标记靶分子,通过对每个微粒的鉴定,得到统计学数据(提供细胞群体的均值和分布情况)
应用:
对混合细胞中的靶细胞做定性、定量、分选。
灵活,可多标;
精确,分离效果较好;
时间及经济成本较高。
2、磁珠分选术:
用于单参数的分选,方法简单,消毒方便,在应用于多参数分选的时候步骤繁复。
磁珠分选与流式分选比对:
磁珠
流式
条件
有流式数据
略
应用建议
长期大量应用
略
单参数分选
可4参数
特点
简单
灵活、复杂
无菌条件好
相对消毒
(二)单个细胞收集:
激光切割技术
常用于收集组化染色后的靶细胞,无菌收集相对不足。
(三)细胞组分分离:
离心法
1、离心机分类:
常速/低速
高速
超速
rpm
<
1万
~2万
2~8万
RCF
104g
~1×
105g
~6×
105g
分离
细胞、细胞核
细胞、细胞器
细胞器,病毒,核酸,核糖体,蛋白质
2、离心机使用注意事项(见下)
四、离心机:
1.RCF(简称g值):
相对离心力场(RCF)=离心力场/重力场
离心力场α=旋转角速度2×
离心半径=ω2r
离心力场:
描述离心力场的强度,用离心加速度的大小来表示。
RCF的物理意义:
该转头所产生的最大离心力场是重力场的多少倍。
2.使用注意:
一般注意:
①配平;
②转速<
最高极限;
③平稳运转后离开;
④清洁
超速离心注意:
①离心管。
封管确实(免抽干);
②转头,安装稳妥;
③转速,旧转子需打折转速;
④检查,不可有任何伤痕。
五、共焦显微镜、流式细胞仪分别用于什么实验?
共焦显微镜:
显微镜水平对单个细胞内靶分子的研究。
如:
靶蛋白定位、定性、定量分析。
并可扩展研究分子间相互关系、分子动态分析、三维成像等等。
流式细胞仪:
识别一群微粒中含有某些特性的微粒(亚细胞群、特定颗粒)。
原理:
用荧光标记靶分子,通过对每个微粒的鉴定,得到统计学数据(提供细
胞群体的均值和分布情
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