重组人胰岛素信息资料Word文档格式.docx
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摘要
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提供了改进且有效的通过折叠胰岛素原杂交多肽来生产重组人胰岛素的方法。
摘要附图
窗体顶端
发明名称--Generationofhumaninsulin
C12N15/17;
C12N15/16
BIOTECHNOLOGYGENERALCORP;
HARTMANJR;
MENDELOVITZS;
GORECKIM;
Abstract:
Animprovedandefficientprocessfortheproductionofrecombinanthumaninsulinbyfoldingofaproinsulinhybridpolypeptideisprovided.
窗体底端
1.生产胰岛素的方法包括:
(a)在允许形成正确二硫键的条件下,折叠含胰岛素原的杂种多肽;
(b)使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素;
(c)纯化胰岛素。
2.根据权利要求1的方法,其中步骤(a)还包括在约pH8.5-12.0,约4-37℃将杂种多肽保温约1-30小时。
3.根据权利要求2的方法,其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。
4.根据权利要求2的方法,其中pH为11.0-11.25。
5.根据权利要求3的方法,其中pH为11.0-11.25。
6.根据权利要求3的方法,其中在折叠混合物中,抗坏血酸的浓度为每摩尔SH基约2摩尔抗坏血酸。
7.根据权利要求2的方法,其中所述保温时间为约5小时。
8.根据权利要求3的方法,其中所述保温时间为约5小时。
9.根据权利要求1的方法,其中步骤(b)还包括:
(I)将pH调到约8.8-9.0;
和
(ii)在16-37℃用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解杂种多肽30分钟-16小时。
10.根据权利要求1的方法,其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和RP-HPLC纯化。
11.根据权利要求1的方法,其中步骤(c)还包括用超滤和CM-Sepharose层析纯化。
12.根据权利要求1的方法,其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和苯基-Sepharose层析。
13.根据权利要求1的方法,其中用ATCC保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。
14.根据权利要求1的方法,其中用ATCC保藏号为69363的质粒pλBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。
15.根据权利要求1的方法,其中用ATCC保藏号为69362的质粒pBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。
16.根据权利要求1的方法,其中通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞,以便DNA指导所述多肽的表达,从而得到步骤(a)的杂种多肽。
17.根据权利要求16的方法,其中从所述细胞中回收杂种多肽。
18.根据权利要求16的方法,其中所述处理包括存在葡萄糖,甘油或半乳糖的条件下发酵。
19.根据权利要求17的方法,其中所述回收包括:
(I)破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物;
(ii)通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物;
(iii)增溶所述沉淀物。
20.含有胰岛素原和与所述胰岛素原的N-末端相连的前导肽的多肽,其中所述多肽被折叠并含有正确的二硫键。
21.根据权利要求20的多肽,其中所述前导肽衍生于CuZnSOD的N-末端。
22.根据权利要求21的多肽,其中所述前导肽含有62个氨基酸,其前为氨基酸Met,其后为Arg残基。
23.根据权利要求20的多肽,其中所述胰岛素原含有通过单Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。
24.根据权利要求20的多肽,其中所述胰岛素原含有通过二肽Lys-Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。
25.根据权利要求20的多肽,其中前导肽的Cys残基已经被Ser残基所取代。
说明书
生产人胰岛素
这是美国系列申请08/175298,1993年12月29日申请的接续申请。
发明背景
在本发明说明书中,用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。
在说明书后,权利要求前可以找到这些参考文献的所有引述。
将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。
胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的多肽激素,每天施用给患糖尿病的患者,糖尿病是胰岛素供应不足而引起的代谢紊乱。
体内,首先将该激素合成成长前体分子,随后加工成由A和B链组成的其生物活性形式。
更详细地说,在内分泌胰腺的β细胞内,将前原胰岛素的基因转录成mRNA前体,然后剪接生产成熟mRNA。
将所述mRNA翻译成前原胰岛素(NH2-前区-B链-C肽-A链-COOH),接着再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。
该过程的第一步就是蛋白水解除去前区,该区是通过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。
在人前原胰岛素中,前区的长度是24个氨基酸。
在胰岛素原中,将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区,B-和A链通过C肽(或C-链)彼此相连,所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。
在大多数C肽中,这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。
人C肽,包括两个侧对的碱性氨基酸,含有35个氨基酸。
C肽与所述多肽的两个部分相连以便有助于在B和A片段之间形成二硫键。
因此,C肽的作用很大程度上不依赖其结构。
事实上,用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子(1,2)。
胰岛素原折叠,同时发生两个链间二硫键和一个A链二硫键的氧化。
在成熟化的最后阶段,蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放C肽并形成成熟胰岛素(3)。
在人胰岛素中,A链有21个氨基酸,B链有30个氨基酸。
世界上每年胰岛素的需求超过数吨,而且严重供不应求。
传统上,胰岛素是从有限的动物源中生产的,主要是牛和猪胰腺制品,它们不同于人胰岛素,因此会引发有害的免疫反应。
在六十年代完成的研究表明,可以体外生产胰岛素。
通过用其S-磺化形式(4)将A和B链结合或通过自发再氧化还原的胰岛素原(5)来合成胰岛素。
后一种方法由于在氧化混合物中蛋白质浓度很低,不能用于大规模生产胰岛素。
在用胰蛋白酶和羧肽酶B处理后(6),可以回收胰岛素。
最近半合成和生物合成的(重组)人胰岛素也可以得到。
半合成的人胰岛素是通过胰蛋白酶催化B链30位的Ala换成Thr(是猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一不同)而从猪胰岛素生产的。
在大肠杆菌或酵母中生产的重组人胰岛素最终将取代所有其它生产途径。
现在通过两种途径制备半合成重组人胰岛素:
在大肠杆菌中分开生产A和B链,然后将其结合在一起(7,8),或酶促转变在大肠杆菌(1,8)或酵母(2,9)中表达的胰岛素原等多肽。
在大多数情况下,胰岛素原是作为杂种蛋白质而生产的,以细胞内沉淀蛋白质的形式积累。
正常纯化所述杂交物,然后用CNBr裂解以释放胰岛素原多肽。
后者再通过氧化亚硫酸水解(sulfitolysis)修饰得到胰岛素原S-磺酸盐。
然后在还原条件下纯化并折叠胰岛素原S-磺酸盐,得到胰岛素原(8)。
通过胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的联合作用将胰岛素原转变成胰岛素。
专利公开EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式为B-Lys-Arg-A的胰岛素原以及其用于在酵母中制备胰岛素的用途。
专利公开EP196056B1(ChironCorp.,)描述了用酵母生产的hSOD-胰岛素原蛋白质。
在折叠前,使hSOD-胰岛素原蛋白质经溴化氰裂解和亚硫酸水解。
Hoechst在EPO379162中描述了可以将’胰岛素前体的错重组体“(即,有不正确或部分不正确分子间二硫键的重组胰岛素产物)不通过亚硫酸水解,而是在有机氧化还原系统的存在的条件下,在含水介质中通过将错重组体与过量硫醇反应而转变成正确的胰岛素产物。
在氨基酸或肽基从融合多肽裂解后(化学或酶促)(发生在宿主细胞溶解后)进行源(original)亚硫酸水解(sulfitolysis)步骤,因为然后要将胰岛素前体的6个半胱氨酸转变成其S-磺酸盐。
在随后的复性步骤中,通过形成三个正确的二硫键而从所述胰岛素原S-磺酸盐生产天然胰岛素原。
在该复性步骤,产生了所谓“错重组体”。
Hoechst在PCTWO91/03550中还公开了制备含所需蛋白质(如胰岛素原)和“平衡组分”的方法。
亚硫酸水解在折叠前完成,而在折叠后,与胰岛素原的C-链同时裂解掉“平衡组分”。
另外,Hoechst在EP347781B1中描述了“小胰岛素原”(B-Arg-A)和其用于致病单-Arg胰岛素和胰岛素的用途。
他们还描述了含有B-Arg-A和“平衡组分”的融合蛋白质。
在折叠多肽前,用溴化氰裂解“平衡组分”并完成亚硫酸水解。
本发明公开了用改进并有效的方法生产重组人胰岛素。
在大肠杆菌中合成含有前导序列的重组胰岛素原杂种多肽。
部分纯化后,在可以进行之前折叠的条件下,将其折叠,但仍连接着前导肽。
然后通过用胰蛋白酶和羧肽酶B结合处理而产生有生物活性的人胰岛素,其中这些酶同时裂解掉了前导肽和C链。
因此生产的纯化人胰岛素与天然产生的人胰岛素相同。
在杂种多肽的CNBr裂解和用于保护丰富SH基团的亚硫酸水解中所涉及的有害和麻烦的过程在所述新方法中除去了,因为可以将完整的胰岛素原杂种多肽有效折叠成其天然结构,甚至是在存在前导肽和未保护的半胱氨酸的情况下。
通过酶促裂解释放活性重组人胰岛素,然后将其纯化。
附图的简要描述
在附图3-5中所列三个质粒的限制图谱中,并未鉴定出在这些质粒上的所有限制位点。
但是,列出了完全理解本发明所必需的那些限制位点。
图1:
通过酶促裂解表达质粒pBAST-R而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽,从而得到人胰岛素。
只表明了部分SOD前导序列。
图2:
通过酶促裂解表达质粒pBAST-LAT或质粒pλBAST-LAT而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽,从而得到人胰岛素。
只表明了部分SOD前导序列。
图3:
质粒pBAST-R的结构,编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒,保藏号为ATCC69362。
图4:
质粒pDBAST-LAT的结构,编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒,保藏号为ATCC69361。
图5:
质粒pλBAST-LAT的结构,编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒,保藏号为ATCC69363。
图6:
用质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。
图7:
用质粒pDBAST-LAT和pλBAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。
图8:
人胰岛素生产,来自用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽,作为折叠混合物pH的函数。
在4℃,经16小时,用1mg/ml或0.5mg/ml杂种多肽,在100mM甘油中,于不同pH完成胰岛素原杂种多肽的折叠(按实施例2所述生产的)。
37℃,pH9用(胰蛋白酶1∶500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB,Sigma,1∶200w/w)将折叠材料处理30分钟,然后通过利用1251-胰岛素(Amersham)和人重组胰岛素(Calbiochem)为标准的放射性免疫检测法检测免疫反应性(IR)。
图9:
用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素
将胰岛素原杂种多肽(按实施例2所述生产的)溶解在8M脲,浓度为约30mg/ml的5mMHCl,然后用100mM甘油-NaOH稀释1mg/ml,pH11.0中。
在22℃(室温)折叠20小时。
然后用HCl将pH调到8.8。
加入羧肽酶B(1∶1000w/w,Sigma)和胰蛋白酶(1∶2000w/w,Sigma)在37℃将反应混合物保温60分钟。
在用10mMHCl稀释前,将消化混合物酸化到pH3。
在250×
4mm,5μLichrosphere100RP-8柱(Merch)上,通过反相高压液体层析(RP-HPLC)分析150μl的样品,所述柱用含31.5%(v/v)乙腈的50mM磷酸四乙胺,162mMNacl4,pH3平衡。
用31.5%-40.5%乙腈的现象梯度,在75分钟内,以1ml/分的流速使该柱展开。
检测在220nm的吸收值。
A:
5ug标准胰岛素(Boehringer-Mannheim);
B:
酶促处理后产生的重组人胰岛素;
C:
折叠的SOD-胰岛素原杂种多肽。
图10:
质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素作为折叠混合物中pH的函数
将胰岛素原杂种多肽(按实施例2中所述生产的)用有标明pH值的100mM甘油-NaOH缓冲液稀释到1mg/ml,然后在22℃折叠16小时。
按图9所述完成酶处理和RP-HPLC分析。
根据与标准胰岛素有相同滞留时间的峰的面积计算从杂种多肽产生的重组人胰岛素的量。
图11:
质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素作为折叠混合物中抗坏血酸浓度的函数
存在标明抗坏血酸浓度的条件下,在100mM甘油-NaOH,pH11.2中,于22℃以1mg/ml折叠SOD-胰岛素原杂种多肽(按实施例2所述生产的)。
在5和25小时的折叠过程后,用胰蛋白酶和羧肽酶B(按图9)处理样品。
在RP-HPLC(按图9)上分析重组人胰岛素产品。
图12:
从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素的可靠性
22℃,,在100mM甘油-NaOH,pH11.2和1.2mM抗坏血酸中,22℃以1mg/ml折叠SOD-胰岛素原杂种多肽16小时。
酶处理后(按图9),在用20mMTris-HCl,pH8平衡的DEAE-Sepharose柱上层析分析所述混合物。
用在20mMTris-HCl,pH8中0-0.4M的NaCl现象梯度洗脱重组人胰岛素。
收集峰部分,然后用HCl酸化到pH3。
再按图9所述,用RP-HPLC从胰岛素样分子进一步纯化重组人胰岛素。
收集主峰,用0.25M乙酸在SephadexG-25柱上脱盐,然后冻干。
用制备于10mMHCl中的样品(5ug重组人胰岛素),在相同的条件下用RP-HPLC分析。
标准胰岛素;
HPLC纯化的重组人胰岛素;
HPLC纯化的重组人胰岛素和标准胰岛素的组合样品。
图13:
从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素作为蛋白质浓度的函数
在100mM甘油-NaOH,pH11.2中,按标明的0.5mg/ml-10mg/ml的终蛋白质浓度,折叠SOD-胰岛素原杂种多肽(按照实施例2所述生产的)。
用每molSH基2.5mol抗坏血酸补充各折叠混合物。
24℃(室温)折叠16小时。
按照图9中的描述完成酶促处理和RP-HPLC分析。
图14:
用质粒pDBAST-LAT表达的,来自粗细胞内沉淀的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素,作为折叠时间的函数
以每ml约2.6A280的浓度,将细胞内沉淀溶解在20mM甘油-NaOH,33uMEDTA,pH11.2中。
用10N氢氧化钠将pH调到12。
将溶液放置并搅拌10分钟。
用浓缩的盐酸将pH滴到11.2。
加入活化的活性炭(酸洗涤的,Sigma)到0.1%w/v的终浓度,然后将混合物搅拌30分钟。
澄清上清液的A280为约2.15。
补充抗坏血酸达到3mM终浓度。
在室温(22-23℃)剧烈搅拌,按所示折叠胰岛素原杂种多肽。
在试验的不同时间点(从溶解开始),依次取10ml样品,滴到pH8.8,然后存在50uMZnCl2的条件下,用羧肽酶B(1∶1000w/w)和胰蛋白酶(1∶2000w/w)消化。
按图9所述,用RP-HPLC分析确定各消化样品中的胰岛素含量。
根据胰岛素的增加(消化后),游离SH基降低的水平确定折叠反应的进展,用Ellman反应(16)检测后者。
本发明概述
本发明提供了生产人胰岛素的方法,包括在允许正确二硫键形成的条件下,折叠含胰岛素原的杂种多肽,使折叠的,二硫键结合的杂种多肽经酶促裂解产生活性人胰岛素,然后纯化活性人胰岛素。
本发明还提供了含胰岛素原以及与所述胰岛素原N-末端相连的前导肽的多肽,其中所述多肽被折叠,并含有正确的二硫键。
本发明的详细描述
按照并符合布达佩斯条约对用于质粒目的的微生物保藏之国际承认的要求,将在大肠杆菌中的质粒pBAST-R,pDBAST-LAT,pλBAST-LAT于1993年7月26日保藏在美国典型培养物收集中心(ATCC)(12301ParklawnDrive,Rochville,Maryland20852)保藏号分别为69362,69361和69363。
如本文所用的,杂种多肽含有与所需多肽共价相连的前导肽。
本发明的杂种多肽含有胰岛素原,优选含有作为前导肽的SOD。
如本文所用的,折叠包括折叠杂种多肽,所述杂种多肽含有在折叠前,未用CNBr裂解,而且在折叠前未进行亚硫酸水解以保护SH基团的胰岛素原,其中折叠可以使得在所述杂种多肽中形成正确的二硫键。
如本文所用的,杂种多肽形成正确的二硫键包括在胰岛素的CysB7-CysA20,CysB19-CysA20和CysA6-CysA11之间形成三个二硫键(按照成熟胰岛素中的编号标注Cys残基)。
如本文所用的,胰岛素原含有包括胰岛素B,C和A链,从N-末端到C-末端的多肽。
如本文所用的,胰岛素的C-链肽含有天然产生的C-肽和任何其它可以通过胰蛋白酶和羧肽酶B裂解的寡肽,二肽或单氨基酸。
如本文所用的,前导肽含有与胰岛素B链共价相连的任何肽或多肽,所述前导肽使得可以进行折叠并形成二硫键,而且可以用胰蛋白酶裂解。
前导肽优选是SOD。
如本文所用的,SOD包括任何实质部分的CuZnSOD或MnSOD的氨基酸序列,而且所述部分不必有SOD的生物学活性,与天然产生的SOD的氨基酸序列相比,所述部分也不必有相同的氨基酸序列。
用本领域已知的方法,如Bauer等人(1985),Gene,37:
73-81可以突变编码SOD的DNA。
前导肽除SOD外,可包括任何其它肽,多肽或蛋白质或任何所述肽,多肽或蛋白质之任何实质部分的氨基酸序列,其中所述部分既不必有是肽,多肽或蛋白质的生物学活性,与天然产生的肽,多肽或蛋白质相比,所述部分也不必有相同的氨基酸序列;
然而,前导肽必须允许杂种多肽折叠并形成正确的二硫键。
如本文所用的,胰岛素可以包括天然胰岛素的同系物。
如本文所用的,胰岛素原可以包括天然胰岛素原的同系物。
如本文所用的,与用本发明方法生产的胰岛素多肽有关的术语“同系物”指与胰岛素有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的生物学活性的多肽。
因此,同系物可以因一个或多个非必需氨基酸残基的增加,缺失或取代而不同于用本发明方法生产的胰岛素多肽,只要所得的多肽保留了胰岛素的生物学活性。
本领域技术人员用熟知的方法,包括,例如用于设计制备DNA序列的常规方法,所述DNA序列用于细菌表达多肽之多肽同系物,通过定点诱变技术修饰cDNA和基因组序列,构建重组蛋白质和表达载体,细菌表达多肽以及用常规生物化学方法检测多肽的生物化学活性,很容易确定可以增加,缺失或取代哪个氨基酸(包括可以用哪个氨基酸进行取代)。
胰岛素同系物的上述定义等同用于胰岛素原的同系物。
用本发明方法生产的胰岛素同系物的实例是含有少于天然胰岛素之所有残基的缺失同系物,其中一个或多个特定残基由其它残基取代的取代同系物以及其中一个或多个氨基酸残基增加到所述胰岛素多肽末端或中间部分的增加同系物,所有这些均有胰岛素的生物学活性。
同系物的实例是在EPO专利申请EP384472中公开的类似物以及在“EliLillyandCompanyReporttoShareholder1992”中公开的EliLilly的胰岛素类似物“Humalog”。
本文将基本上相同的氨基酸序列定义为包括氨基酸序列中的取代和/或缺失和/或增加,而且根据例如由AlbertL.Lehninger,Biochemistry,第二版,WorthPublishersInc.(1975),第4章;
Creighton,蛋白质结构,实践方法,IPLPressatOxfordUniversityPress,Oxford,England(1989);
和MargaretO.Dayhoff,AtlasofProteinSequenceandStructure,Vol.5,TheNationalBiomedicalResearchFoundation(1972),Chapter9描述的同源或等同基团,可包括最多达10个残基。
所述取代是本领域专业人员熟知的。
用本领域专业人员熟知的方法,例如Baueretal.,(1985),Gene37:
73-81可以突变编码胰岛素多肽的DNA。
胺本文所述,可以将突变序列插入到适宜的表达载体中,再将所述载体导入到然后再处理的细胞中,以便突变的DNA表达多肽同系物。
含有编码含胰岛素原之杂种多肽的序列的本发明质粒可以在细菌,酵母,真菌或哺乳动物细胞如CHO,鸡胚胎,成纤维母细胞或其它已知的细胞系中表达,它们通常还含有在细菌,酵母,真菌或哺乳动物细胞中表达克隆基因所必需的调节元件,随编码杂种多肽的核酸这样定位,以便使其进行表达。
表达所需的调节元件包括与RAN聚合酶结合的启动子序列和与核糖体结合的核糖体结合位点。
本发明的质粒表达含胰岛素原的杂种多肽。
本发明的专业人员可以理解:
用已知技术(如通过定点诱变或插入接头)可以很容易改变与本申请有关的保藏的质粒以表达同源多肽。
在例如SambrookJ.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.(1989)分子克隆:
实验室操作手册,第二版,冷泉港实验室出版社中描述了所述技术。
适宜的调节元件位于与编码含胰岛素原之多肽的DNA有关的质粒内,以便在适宜的宿主细胞中影响所述杂种多肽的表达。
在本发明优选的实施方案中,调节元件位于编码杂种多肽之DNA的附近和上游。
本发明还包括各种核糖体结合位点(RBS),用于提供从编码含胰岛素原之杂种多肽的DNA转录的mRNA,以便结合宿主细胞内的核糖体,如deoRBS。
本发明的质粒还含有ATG起始密码子。
编码含胰岛素原之杂种多肽的DNA与ATG起始密码子同相。
本发明的质粒还包括含复制源点的DNA序列,它们来自
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