从大豆婴儿配方奶粉中提取抗氧化肽文档格式.docx
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所有化学试剂均为分析纯。
硫胺素(B1),核黄素(B2),烟酸(B3)、吡哆醇(B6),生物素(B7)、叶酸(B9)和钴胺素(维生素B12)来自Sigma,泛酸(B5)和抗坏血酸(C)来自Fluka(Buchs,Switzerland),维生素B1,B3,B5,B6,B9,C(1mg/mL)和B12(4mg/mL)溶于水中。
维生素B2(1mg/mL)和B7(0.5mg/mL)因其低溶解度,溶解于20mmol/L的碳酸氢钠溶液中。
五种不同的大豆婴儿配方奶粉购买于当地的药店并于室温下储藏。
奶粉1-4是适合刚出生的婴儿服用,而奶粉5适合超过六个月大的婴儿服用。
2.2从婴儿配方奶粉中分离多肽
奶粉样品按制造商规定的量(1g奶粉溶解成6mL的溶液)溶解。
为了从奶粉中的蛋白质和其他组分中的分离出多肽,提出了许多方法。
方法1、按配比将奶粉与12%的三氯乙酸混合(Calvo&
Gomez,2002),混合物在超声波条件下处理5分钟,然后在4℃、4000r/min的条件下离心10min。
方法2、按DiGirolamo等的做法并略作修改(DiGirolamo,D’Amato&
Righetti,2012),样品溶解于40℃的温开水中,煮沸15min,加入三氯乙酸使最终三氯乙酸浓度在5%,继续煮沸15min,在冰箱中放置1h,然后于4℃、4000r/min的条件下离心10min。
方法3、用截留分子量为10KDa的密理博过滤器在25℃、4000r/min的条件下离心1h对方法2得到的提取物进行超滤。
方法4、将奶粉与40℃的温开水混合,并用截留分子量为10KDa的密理博过滤器在25℃、4000r/min的条件下离心1h进行超滤。
在所有方法中,提取物都通过0.45um的可再生纤维素膜过滤并在-20℃条件下储藏备用。
2.3多肽提取物和维生素的分离
多肽提取物,各肽段以及维生素溶液通过安捷伦科技公司的液相色谱仪(SantaClara,CA)进行分离,使用AscentisExpressPeptideES-C18色谱柱(100mm×
2.1mmI.D.,粒度大小2.7um)和AscentisExpressGuard色谱柱(5mm×
2.1mmI.D.,粒度大小2.7um),bothfromSupelco(Bellefonte,PA)。
色谱条件:
流动相A是超纯水-0.1%(v/v)的三氟乙酸;
流动相B是丙烯腈-0.1%(v/v)的三氟乙酸;
洗脱梯度:
5–95%Bin30min;
95–5%in5min;
温度25℃;
流速0.3mL/min;
进样量2ul;
多肽紫外检测波长为210、254、280nm;
维生素检测波长为210、245、265、280nm。
2.4多肽提取物的分离纯化
2.4.1超滤
使用截留分子量为10KDa的超滤器(Millipore)对从各奶粉中得到的多肽提取物循环超滤,然后通过截留分子量5KDa的Vivaspin500聚醚砜树脂(SartoriousStedimBiotech,Goettingen,Germany)过滤,再用截留分子量3KDa的超过滤器(Millipore)过滤。
所有的肽段部分(5-10KDa、3-5KDa、<
3KDa)加水恢复到原有体积。
2.4.2等电聚焦电泳分离
经超滤分离得到的各样品的最佳活性部分按他们的等电点不同被进一步分离。
为了达到那个目的,使用3100游离胶分馏器(AgilentTechnologies)和一个固定化pH梯度从3到10并分为24个pH段的的凝胶条(GeneralElectricHealthcare,Freiburg,Germany)。
通过向每个pH段添加40uL的聚焦缓冲液(12%(v/v)丙三醇和两性电解质(pH3-10))在组合设备中使固定化pH的凝胶条复水。
0.72mL的多肽溶液与2.88mL的聚焦缓冲液混合,取150uL的混合液加入到电泳设备中。
为了获得最佳的多肽聚焦,使用最大电流50uA并且电泳一直持续到达到50KV/h。
2.4.3从多肽液中分离两性电解质
通过使用瓦里安OMIX固相填充移液器C18吸头(VarianInc.,Cary,NC)、多肽清洁C18旋转管(AgilentTechnologies)以及反相高效液相色谱来分离经电泳后的多肽中存在的两性电解质。
反相高效液相色谱通过使用Merck公司的整体柱(100mm×
4.6mmI.D.)进行分离,并且通过安捷伦公司的自动分离收集装置收集多肽。
最佳分离条件为:
流动相A:
超纯水/0.1%(v/v)三氟乙酸;
流动相B:
丙烯晴/0.1%(v/v)三氟乙酸;
流速:
0.5mL/min;
温度:
25℃;
进样量:
10uL;
洗脱梯度:
5–95%in10minand95–5%in2min。
检测波长为210nm和280nm。
在分离过程中,目标样在6.8-10min之间收集。
收集的部分浓缩机复水于100uL水。
2.5邻苯二甲醛法
提取物中多肽的浓度通过邻苯二甲醛法测定,并略作修改(Wangetal.,2008)。
使用Lambda35(Perkin-Elmer,Waltham,MA)分光光度计和小容量的比色皿(UVetter_,Eppendorf,Hamburg,Germany)。
操作过程为:
2.5uL样品加100uLOPA试剂(2.5mL0.1mol/L硼砂、1mL5%(w/v)SDS、100uL40mg/mLOPA甲醇溶液、10uLβ巯基乙醇、1.39mL的水)。
然后于室温下放置8min,在340nm下测吸光值。
多肽含量的计算通过由0~5mg/mL谷胱甘肽绘制的标准曲线测得。
2.6抗氧化活性检测
抗氧化能力由清除DPPH、ABTS以及羟基自由基的能力来评估,每种方法都做空白试验。
三种方法每个样本都测定,且至少平行三次。
2.6.1DPPH自由基清除率
使用You等的方法斌略作修改,取50uL样品与50uL0.1mmol/LDPPH(溶于95%乙醇)混合,于室温、避光的条件下静置30min,在540nm下测吸光值。
以谷胱甘肽(0-5mg/mL)做阳性对照。
DPPH自由基清除率的计算方式如下:
式中:
A1为样液也DPPH混合吸光值
A2为样液与95%乙醇溶液吸光值
A3为蒸馏水与DPPH溶液吸光值
2.6.2ABTS自由基清除率的测定
ABTS法按Wiriyaphan等的方法进行测量。
ABTS储备溶液的配置:
用10mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解ABTS和过硫酸钾,使其最终浓度分别为7.4mmol/L和2.6mmol/L,避光静置16h。
在分析使用前,先用10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)将ABTS储备液稀释为工作液,使其在734nm处的吸光值达到
。
经1uL的样液与100uL的ABTS工作液混合,恒温培养6min,在734nm处测吸光值。
在测定前,以不同浓度(0-5mg/mL)的Trolox代替样液,做阳性对照。
ABTS自由基清除率计算如下:
A0为蒸馏水与ABTS工作液反应的吸光值
A1为样液与ABTS工作液反应的吸光值
2.6.3羟基自由基清除率
使用Ajibola等人的方法测量样品羟基自由基,并略作修改。
25uL的样品与25uL3mmol/L的硫酸亚铁溶液和3mmol/L的邻二氮菲溶液(溶解液0.mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液)混合,加入25uL0.01%(v/v)的过氧化氢溶液启动反应。
在37℃条件下反应1h,于536nm处测吸光值。
不同浓度的谷胱甘肽(0-5mg/mL)溶液做阳性对照。
羟基自由基清除率计算如下:
A1为加样品的吸光值
A2为用蒸馏水替代样品的吸光值
A3为用蒸馏水替代过氧化氢的吸光值
2.7模拟胃肠消化实验
按Garrett,Failla,&
Sarama(1999)的方法对多肽片段进行模拟消化,并略作修改。
简单来说,用1mol/L的HCL调节样液pH值至2,并按酶与底物比为1:
35的比例加入胃蛋白酶。
反应物在37℃下震荡处理1h。
然后,先用0.1mol/L碳酸氢钠溶液调节pH至5,再用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7-8。
将溶解于0.1mol/LpH8的磷酸盐缓冲溶液中的胰蛋白酶按酶与底物比为1:
25的比例加入。
在37℃条件下震荡反应2h。
煮沸10min停止反应。
2.8高效液相-电喷雾/四极杆-飞行时间串联质谱
将安捷伦公司的6530系列串联质谱和1100系列液相色谱仪联用来分离鉴定多肽。
高效液相色谱使用AscentisExpress柱,流动相:
超纯水/0.3%(v/v)AA(流动相A)和丙烯晴/0.3%(v/v)AA(流动相B)。
洗脱梯度从3%到95%B,30min;
从95%到3%B,5min。
0.3mL/min,柱温:
进样量15uL。
同时紫外分光光度计(210nm、254nm、280nm)测量并记录。
质谱仪在阳离子模式下工作,检测质量范围:
100~200。
电喷雾离子的条件:
碎裂器电压:
220V;
喷嘴电压:
0V;
喷雾器压力:
50psig;
毛细管电压:
3500V;
气体温度350℃;
气体流速12L/min;
skimmer,60V。
喷射气体流速和温度分别为:
12L/min和400℃。
串级质谱法采用自动模式,mode,1precursorpercycle,dynamicexclusion
afterthreespectra,andcollisionenergyof35V.MS/MSspectra
wereanalysedusingPEAKSStudioVersion6(BioinformaticsSolutions
Inc.,Waterloo,Canada).AnalysisofdatawithPEAKSsoftware
wasperformedusingthePEAKSproteomedatabasetool.
Resultswerealwaysrefinedusingafalsediscoveryrate(FDR)
of1%.Proteomeofsoybean(Glycinemax)wasdownloaded
fromtheUniProtproteindatabaseandcontainedjustreviewed
proteins(380proteins).
2.9统计分析
统计结果通过软件StatgraphicsPlus5.1(StatpointTechnologies,Inc.,Warrenton,VA)进行分析。
为了发现各结果之间的差异,对每个样品进行三次平行试验,并进行方差分析。
3结果于讨论
3.1提取方法的选择
为了研究大豆婴儿配方奶粉中的多肽组成,测定了两种不同的提取方法(方法1和2)去除蛋白质的能力。
五种奶粉都用两种方法进行提取,并通过OPA法对多肽浓度进行测定,结果见图一。
方法1对于所有的奶粉都表现出低多肽得率,多肽浓度大概在0.84-1.34mg/mL。
而方法2基本上是方法1的两倍(1.83-2.90mg/mL)。
这个结果产生的原因可能是使用方法1时,多肽和蛋白发生了联合沉淀,也有可能是使用方法2时蛋白质没有完全去除。
为了确定方法2已经完全去除了蛋白质,且OPA法测量时没受到蛋白质的干扰,对其通过一个10KDa分子截留量的超滤器进行超滤(方法3)。
通过方法3得到的多肽浓度显著地低于方法2(方差分析,P<
0.05)。
而方法1的通过方法3处理则得到显著提高(方差分析,P<
之前的原因是多肽与蛋白质联合沉淀了,采用方法一。
包含了超滤过程的方法4被使用并与方法3得到的多肽浓度进行对比。
结果显示,方法4的结果(1.19-2.27mg/mL)与通过方法3得到的结果(1.09-2.13mg/mL)相似。
不同奶粉之间的一个比较显示出奶粉5具有较高的水解度(11.4%),但与其他四种奶粉之间的差异不显著(方差分析,P<
有趣的是,奶粉1-4是为新生儿准备的,而奶粉5是为大一点的婴儿准备的。
使用三种不同的方法对通过四种提取方法得到的奶粉提取物的抗氧化活性进行测定,结果见图B-D。
在大部分结果中,抗氧化活性间存在着很显著的差异(方差分析,P<
大体上来看,所有提取物都表现出较高的抗氧化活性,他们之间不同的观测值是因为不同提取方法得到的多肽浓度不同。
正如预期的那样,由方法一所得到的提取物总是表现较低的抗氧化活性,而方法4所得提取物则是最高的抗氧化性之一。
也有在预期之外的,尤其是在使用DPPH法测量时,方法2的表现出非常高的抗氧化活性。
这些较高抗氧化活性可能源自于使用这种提取方法提取多肽时一起提出的蛋白质。
立足于这些结果和方法四的简单,选择此方法进行进一步研究。
最大限度的区分开刚出生的婴儿使用的奶粉(1-4)和超过六个月的婴儿使用的奶粉5是很重要的。
尽管奶粉5得到的多肽浓度较高,但抗氧化活性之间们有较明显的差别。
通过截留分子量10KDa超滤器超滤后得到的提取物种然可能包含小分子(如维生素、矿物质和氨基酸等),这些可能有助于抗氧化活性。
因此,为了确定这些小分子是不存在的,需要更加深入的研究。
根据制造商的标签,奶粉中添加的最多的抗氧化活性物质是维生素。
奶粉提取物被注入一个色谱系统,进行色谱分离,并按奶粉中维生素(C,B1,B2,B3,B5,B6,B7,B9和B12)的添加量配置的溶液作同样处理进行比较。
所有的奶粉提取物得到的色谱图都非常的相似,出现多肽的峰时间大概是5-17min。
维生素B1、B3、B5、B6和Celutedinthedeadvolume,而维生素B2、B7、B9和B12大约在6.6-8.2min被洗脱出来。
那些在多肽洗脱时间被洗脱出来的维生素通过添加跟踪剂来检测。
结果显示这些维生素并不存在与多肽提取物中。
3.2多肽提取物的分离
多肽提取物首先通过不同截留分子量的超滤膜进行超滤,使多肽部分分为三个部分:
5-10KDa、3-5KDa、<
3KDa。
然后测量各部分的多肽浓度及抗氧化活性,观察它们之间的统计学差异(P<
显示出最高多肽浓度的部分总是5-10KDa或者<
3KDa的部分(见图2A)。
ABTS实验结果(2B)表明具有最高ABTS自由基清除率的是5-10KDa的部分,其次是<
3KDa的部分。
DPPH实验结果(2C)同样表明5-10KDa的部分和<
3KDa的部分都具有较高的自由基清除率。
羟基自由基实验结果(2D)显示5-10KDa(16.8-27.6%)比<
3KDa(19.6-20.8%)的部分具有相似或较高的自由基清除率。
因为分子量在5-10KDa的部分在大部分的试验中都表现出较好的抗氧化活性,因此选择其进行下一步试验。
它的高抗氧化活性可能与高水解度和这部分多肽中含有芳香族氨基酸有关。
更主要的是,这个部分的使用可以确定没有奶粉中的其他配料,如可以干扰抗氧化活性的维生素、矿物质、以及氨基酸。
更组要的是,各奶粉在这个部分没有显著差异(P<
通过off-gel等电聚焦电泳对5-10KDa的部分进行经一步分离。
OG系统分离多肽是依据它们的等电点并通过添加两性电解质来达到要求的pH梯度。
在这个过程中,OG使用pH3-10的梯度24wells进行分离以达到一个较高的分离度。
然而,OG系统中两性电解质的添加极大的干扰了多肽浓度及抗氧化活性的测定。
更主要的是,尽管商业上合理通用的电解质还不明确,但是已有研究证明其对活性试验有影响(Riazi,Dover,Turovskiy,&
Chikindas,2007)。
因此,需要做空白试验(只用聚焦缓冲液(12%(v/v)丙三醇)和两性电解质(pH3-10)分离),并且收集24wells下的结果。
每个条带下的空白成分通过OPA、ABTS、DPPH法分析(结果见图3)。
OPA在大部分条带处都能检测到,尤其是在强碱性区域。
更主要的,空白试验在ABTS和DPPH自由基清除率检测时都表现除了虚假信号。
因此,一个可以去除两性电介质的方法是必要的。
因为两性电解质是较小的多肽分子,而所检测的多肽是较大的分子(5-10KDa),所以首先可以通过5KDa超滤器超滤去除。
但是结果表明超滤并没有很好地完全去除两性电解质。
分离枪头和纯化柱是近期进入市场可以方便去除多肽混合物中干扰因素的技术,是第二种选择。
分离枪头和纯化柱可以去除大量的两性电解质,但是仍有大量的多肽不能回收。
另一个选择是使用反相液相高效色谱法。
经过优化,通过使用整体柱可以去除两性电解质。
只测定前五个肽段(已经证明在奶粉中主要存在的是酸性多肽)。
收集的部分进行浓缩,再溶解,并通过OPA法和ABTS法进行检测(见图4)。
结果显示,浓度最高的部分始终是第一个条带。
其中,多肽量最低的是奶粉3(0.06-0.17mg/mL),最高的是奶粉5(0.24-0.33mg/mL)。
这些结果和先前的研究一致(图1、2)。
ABTS实验表明,每个条带都包含具有抗氧化活性的多肽。
但是,整个5-10KDa部分的抗氧化活力步通过OG系统分离的任何一个单体都强。
这种协同效果已经在抗氧化剂混合物中被描述过了(Ghiselli,Serafini,Natella,&
Scaccini,2000)。
因此,OG分离被拒绝,整个5-10KDa部分用于进一步研究。
3.35-10KDa部分经胃肠消化后的抗氧化活性评估
整个5-10KDa部分将依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶按之前所述的方法(Garrettetal.,1999)进行消化试验。
每种奶粉提提取物将会消化两次以确保胃肠消化的再现性。
经过消化后的多肽部分通过ABTS法进行测量抗氧化活性。
与样品(seeSupplementalmaterial1)的ABTS自由基清除率相比,奶粉1、2和4的提取物在经胃肠消化后都有所降低,而奶粉3和5在消化前后没有显著差异(t检验,P<
0.05).为了更加明确这一现象,评估和比较了消化前后的多肽含量。
结果(seeSupplementalmaterial1)表明,对于所有的奶粉,经胃肠消化后,多肽含量都有所增加,这说明有一部分多肽被进一步水解了。
这个水解过程可以解释一些奶粉(奶粉1、2、4)经胃肠消化后抗氧化活性的微弱降低。
另一方面,奶粉3和5在消化前后相似的抗氧化活力可能是因为水解出的多肽也具有抗氧化活性。
3.45-10KDa的部分多肽结构鉴定
在通过模拟胃肠消化后,使用反相高效液相色谱及电喷雾/四极杆-飞行时间串联质谱对多肽片段进行分析。
经胃肠消化后的结构分析表明了奶粉中真正的营养成分。
在每种奶粉中至少有120众多肽被检测出,5中奶粉总共检测出278种不同的多肽。
对奶粉中的氨基酸进行分析,结果显示其含有大量的高疏水性(V,I,andL)和芳香族(H,F,W,Y)氨基酸残基,是抗氧化肽的显著特征。
疏水性和芳香族氨基酸残基的百分含量范围从奶粉4的26.75%到奶粉3和5的30.11%和30.66%。
在所有鉴定出的多肽中,有42种在所有的样品中都存在。
这些多肽的分子量大小以及蛋白质来源(蛋白质数据库中所查)都列于表1中。
其中大部分来自大豆球蛋白的亚基(从GLYG1到GLYG5,其中GLY是大豆球蛋白,G1–G5代表亚基);
大豆球蛋白是大豆种子的主要贮藏蛋白(约占大豆贮藏蛋白的40%).其次主要来自另一个大豆贮藏蛋白(约占28%)豆球蛋白的α-链。
已经鉴定出的多肽通过使用生物活性肽数据库BIOPEP来检测。
本研究检测了soystatin(VAWWMY)的部分序列,这个多肽以前被报道称具有强烈抑制胆固醇吸收及胆汁酸粘连的作用(Nagaoka,Nakamura,Shibata,&
Kanamaru,2010)。
这个多肽的抗氧化活性可以解释为其拥有两个芳香族氨基酸残基(W)以及其多肽序列中大部分的疏水性氨基酸。
具有最高抗氧化活性的婴儿配方奶粉(奶粉5)中含有30种独特的多肽。
在BIOPEP数据库中,这些多肽的存在被鉴定。
在这些多肽中,多肽SGDAL在已经报道了的另个较大分子链的多肽中存在,这两个多肽分别为LQSGDALRVPSGTTYY和LNSGDALRVPSGTTYY,都来自于大豆都球蛋白(Chen,Muramoto,&
Yamauchi,1995)
本研究第一次检测了大豆婴儿配方奶粉中抗氧化肽的存在性。
通过对样本用10KDa的超滤器超滤,有效的去除了蛋白质。
通过不同分解截留量的超滤膜多提取物进行纯化以及抗氧化活性的检测,表明分子量在5-10KDa的多肽部分具有最高的抗氧化活性。
5-10KDa的部分进行模拟胃肠消化过程消化,观察表明很好的保留了抗氧化活性。
总共有278种不同的多肽子啊5种奶粉中被检出,其中有42种在5种样品中都存在。
这些多肽中的大部分都具有抗氧化肽的显著特征。
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