苏教版高中生物选修1 42《分子生物学技术》教案Word文档下载推荐.docx
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(重点)
2.PCR技术的基本操作。
(重难点)
【课前自主导学】
一、使用PCR仪的安全措施
1.严禁在PCR仪运行过程中打开盖子,否则会造成仪器的永久损坏。
2.样品池及池盖内表面温度较高,当心灼伤。
3.加热器内腔为高温、高压,严禁触及。
4.仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音,请立即停止运行,检查是否有毛细管断裂等故障。
5.仪器运行过程中如果计算机长时间没有反应,仪器也没有任何动作,请切断电源,进行检查。
6.任何时候打开机器外壳时候,都必须切断电源。
7.必须保持样品池内部清洁,可用体积分数为95%的酒精、湿棉签擦拭相关部位。
8.仪器必须放置在PCR实验室里,操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定,做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。
9.当仪器接通电源后,打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害,因此,在进行任何调整、替换、保养或维修之前,请切断所有的电源。
二、聚合酶链式反应程序
1.向离心管中加入模板DNA、脱氧核苷酸引物和4种脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
2.变性:
在94℃高温下作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA。
3.退火(复性):
反应体系的温度降至40~60℃,使得引物与作为模板的单链DNA上特定部位相互配对、结合。
4.延伸:
反应体系的温度回升到72℃左右,在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对的原则连接在引物之后,使引物链延伸,形成互补的DNA双链。
三、目的DNA片段的体外扩增
(一)DNA片段的PCR扩增
1.准备器材
2.在0.2mLPCR薄壁离心管中加入5μL10×
PCR缓冲液,dACP、dCTP、dGTP、dTTP各5μL,1μL模板,5μL引物1和5μL引物2,29μL双蒸水。
3.煮沸5min之后冰浴2min,低速离心,按照1单位/μL加入Taq聚合酶。
4.扩增DNA片断的反应程序:
将离心管放入PCR仪中,盖上样品池盖。
在94℃的条件下预热,5min,再设置反应程序为:
94℃,30s―→56℃,30s―→72℃,30s(以上过程循环30次)。
最后一次延伸条件为72℃,5min。
运行反应程序。
(二)DNA分子的测定
1.配制二苯胺试剂
2.取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放入两支试管中,加入等量的二苯胺试剂,混匀后观察溶液的颜色。
3.根据蓝色的深浅,可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有明显的增加。
正误判断
1.DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。
(×
)
【提示】 是在94℃高温解链,不需DNA解旋酶的参与。
2.DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶参与。
【提示】 只需将温度降至40~60℃,使引物与模板配对。
3.DNA延伸过程需要Taq聚合酶的作用。
(√)
4.所有PCR中使用的引物都是相同的。
【提示】 引物的序列是依据被扩增区域的3′端边界DNA序列确定的。
【课堂互动探究】
一、PCR技术的反应原理与反应过程
【问题导思】
①如何理解PCR技术的反应原理?
②怎样理解PCR的反应过程?
1.PCR解旋与复旋的原理:
DNA热变性的原理
2.PCR的反应过程
(1)变性:
当系统温度上升到90℃以上时,双链间的氢键打开,DNA解旋为单链,如图:
(2)复性:
当系统温度下降到50℃左右时,两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合,如图:
(3)延伸:
当系统温度上升到72℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸(A,G,C,T)在DNA聚合酶的作用下,从引物的3′末端开始,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,如图:
3.PCR扩增的计算
理论上DNA呈指数方式扩增。
若开始只有一个DNA提供模板,则循环n次后有2n个;
若开始有N0个DNA提供模板,则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·
2n个。
【名师点拨】
1.PCR原理是高温条件下,在耐高温DNA聚合酶的作用下完成体外DNA的复制。
2.PCR需要适宜,但又不同于细胞内复制的条件。
比如耐热的DNA聚合酶,不需添加解旋酶,不需加生物能量ATP,但需添加PNA或DNA引物,能够人为控制温度和复制周期等。
例1:
近十年来,PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段,其原理是利用DNA半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图),在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链打开,这一步是打开键,称为。
(2)当温度降低时,引物与模板端结合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成两个DNA分子,此过程中原料是,遵循的原则是。
(3)PCR技术的必要条件,除了模板、原料、酶以外,至少还需要三个条件,即:
液体环境、适宜的温度和酸碱度,适宜的温度由自动调控,酸碱度则靠来维持。
(4)DNA的复制需要引物,其主要原因是()
A.可加快DNA的复制速度
B.引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C.引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D.DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
【思维导图】
PCR技术―→关键是明确PCR
技术的原理-
【精讲精析】
(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂,称为变性。
(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样,为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸,遵循的原则是碱基互补配对原则。
引物与模板的3′端结合后,DNA聚合酶才发挥作用。
(3)PCR技术除了需要模板、原料、酶以外,至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度,适宜的温度靠PCR仪自动调控,而酸碱度靠缓冲液来维持。
(4)引物的作用是结合在模板DNA上,提供DNA延伸的起始位点,而DNA聚合酶的作用是从引物的3′端开始催化DNA链的延伸,故选D。
【答案】
(1)氢 变性
(2)3′ 四种脱氧核苷酸 碱基互补配对原则 (3)PCR仪 缓冲液 (4)D
二、实验操作的注意事项
【问题导思】
①实验操作应注意哪些问题?
②PCR扩增成功的关键是什么?
1.PCR所用的缓冲液配制一定要严格,或者直接购买专用扩增缓冲液。
2.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
3.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头必须更换。
4.PCR实验中应注意各种反应成分的用量,用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等,均有可能导致DNA片段扩增的失败。
5.PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段,合理设计引物是PCR成功的关键。
1.PCR扩增过程中要进行无菌操作,避免污染。
2.在操作中离心约10s,目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果。
例2:
下列操作过程的叙述中错误的是()
A.PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的吸液枪头都必须更换
【精讲精析】 为了防止外源DNA等因素的污染,PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等,在使用前要进行高压灭菌;
还要将所用的缓冲液和酶分装成小份;
并且使用一次性吸液枪头,则A、B、D项都正确。
在使用前,将PCR所需试剂从冰箱内拿出来,放在冰块上缓慢融化,则C项错误。
【答案】 C
【双基达标】
1.关于PCR的说法不正确的是()
A.PCR是体外复制DNA的技术
B.Taq聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶
C.PCR过程中需要一个模板DNA、两个引物分子、大量脱氧核苷酸原料
D.PCR利用的是DNA双链复制原理
【解析】 PCR过程中需要模板DNA,过量的寡核苷酸引物和4种脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
2.下列哪项不是多聚酶链式反应(PCR)扩增DNA片段的必需条件()
A.模板DNA片段和四种游离脱氧核苷酸
B.核糖体和DNA解旋酶
C.耐热的DNA聚合酶和引物
D.适宜pH的缓冲溶液和自动温度控制仪器
【解析】 PCR反应需要在一定缓冲溶液中进行,另外,还需提供:
DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,自动温度控制仪器。
通过控制温度使DNA复制在体外进行。
【答案】
3.标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步,这三大步所需的温度依次是()
A.94℃、50℃、72℃ B.72℃、50℃、92℃
C.50℃、92℃、72℃D.80℃、50℃、72℃
【解析】 当温度上升到94℃时,双链DNA解旋为单链,称之为变性;
当温度下降到40~60℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合;
当温度上升至72℃时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。
【答案】 A
4.PCR技术中引物的作用是()
A.打开DNA双链
B.催化合成DNA子链
C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始子链合成
D.提供模板
【解析】 DNA分子的复制具有方向性,DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
5.下面关于DNA对高温的耐受性的说法,不正确的是()
A.DNA对高温的耐受性一般要比蛋白质强
B.超过80℃后DNA将变性,即使恢复到常温,生物活性也不能恢复
C.不同生物的DNA的“变性”温度不一定相同
D.深海热泉附近生活的生物的DNA对高温的耐受性更强,其DNA中鸟嘌呤所占的比例更高
【解析】 蛋白质一般不能忍受80℃以上的高温,一旦达到此温度,其结构往往会发生不可逆转的破坏,而DNA一般在80℃以上情况下才会变性,一旦温度降低,其在高温下解开的两条链又会重新结合成双链,恢复其活性。
由于GC碱基对通过三个氢键相连,所以更稳定。
【答案】 B
6.PCR技术最突出的优点是()
A.原理简单
B.原料易找
C.Taq聚合酶具有耐热性
D.快速、高效、灵活、易于操作
【解析】 PCR技术用途广泛,具有快速、高效、灵活、易于操作的突出优点。
【答案】 D
7.分析回答下列有关生物技术实践的问题:
PCR是一种DNA体外扩增技术,被广泛应用于基因扩增和DNA序列测定。
如图是PCR技术示意图,请回答下列问题:
(1)标准的PCR过程一般分为、、三大步骤。
(2)引物是此过程中必须加入的物质,从化学本质上说,引物是一小段。
(3)将双链DNA,使之变性,从而导致。
(4)引物延伸需提供作为原料。
【解析】
(1)标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是95℃、55℃、72℃。
(2)引物是此过程中必须加入的物质,从化学本质上说,引物是一段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。
(3)在PCR反应过程中,当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链。
(4)当系统温度上升到72℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【答案】
(1)变性 复性 延伸
(2)单链DNA或RNA
(3)加热到94℃
双链DNA解聚成两条单链
(4)4种脱氧核苷酸
8.根据教材知识,回答下列问题。
(1)PCR利用了DNA的原理,在的温度范围内,DNA的解体,分开,这个过程称为。
(2)PCR反应需要的条件:
缓冲溶液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶,其原因是。
(3)在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是。
(4)PCR一般要经过三十多次循环,每次循环可分为、和三步。
(5)若扩增30次,产生DNA片段个。
【解析】 PCR技术中,一般不采用解旋酶处理,而是采用DNA热变性处理;
在95℃左右(80~100℃)DNA变性,氢键断裂,双螺旋打开,类似于生物体内解旋酶的作用;
产生单链后,DNA单链与引物结合,然后利用四种脱氧核苷酸,经过变性—复性—延性三个阶段,完成DNA的扩增。
【答案】
(1)热变性 80~100℃ 双螺旋结构 双链 变性
(2)PCR反应的本质是DNA复制,其需要的条件类似于生物体内DNA的复制
(3)95℃变性
(4)变性 复性 延伸
(5)230
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