响应面优化乳杆菌菌株产共轭亚油酸的工艺研究Word文件下载.docx
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,c
9,
t
11-CLA
和t
10,
c
12-CLA
具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、抑制癌症、减
肥、抗氧化等生理功能及保健作用,同时,
CLA
还具有
改善骨组织代谢、调节血糖
[4]
等功效。
目前,
主要由
化学法和生物法合成得到,化学合成法的产物异构体众
多,成分复杂,分离提纯困难,制约了其在食品医药领
域的应用,也导致
单体在该领域处于垄断地位
[5]
生
物合成法因其反应条件温和,产物成分较单一,在食品
医药领域展现出了良好的应用潜力。
目前,用来生物合成
的微生物主要有丁酸弧
菌
(
Butyrivibrio
)
、丙酸杆菌
Propionibacterium
、乳酸杆
等,这些菌株均可经诱导产亚油酸异
构酶,转化生产具有生物活性的
但丁酸弧菌需要
严格厌氧培养,合成的异构体种类较复杂,应用受到限
制;
而乳酸菌系益生菌,且酶的作用位点在脂肪酸的c
12
双键上,能把
LA
转化为c
,产物可直接从细胞
培养液中提取
[6]
,其发酵条件温和、易控制,生产设备简2142013,Vol.34,No.19食品科学※生物工程
单,具备工程化的应用潜力,筛选较高的
转化率的
乳酸菌属菌株仍是当前的研究热点。
PC-3
菌株系从黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等环
境中筛选出,能转化亚油酸为具有生理活性的共轭亚油
酸
12-CLA)
,经形态学、生理生化实
验及
16SrDNA
序列分析,结合气
-
质联用仪检测方法,鉴
定
菌株为乳杆菌属,该菌株能转化
为具有生理活
性的
本实验以该菌株为研究对象,优化其发酵生产
的工艺条件。
该工艺条件易实施、易实现工业化。
1材料与方法
1.1
材料、试剂与仪器
1.1.1
菌种与培养基
乳杆菌
,自黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等
环境中分离出。
MRS
培养基,
121
℃灭菌
20min
;
脱脂乳培养基
(12g/100mL)
115
15min
1.1.2
试剂
亚油酸
C
18:
(LA
含量
(95
±
1)%
,酸值>
190mgKOH/g
水分含量≤
0.1%)
安庆市中创生物工程有限公司;
共
轭亚油酸
(CLA
含量≥
99%)
、
甲酯
≥
美国
Sigma
公司;
11-CLA(
含量>
90%)
、t
12-CLA(
含
量>
90%)Nucheckprep
正己烷江苏强盛功能
化学股份有限公司;
脱脂奶粉
脂肪含量≤
1.5g/100g
,优质蛋
白含量≥
32g/100g)
内蒙古伊利实业集团股份有限公司。
1.1.3
仪器与设备
SW-CJ-1F
超净工作台苏净集团安泰公司;
HQ45Z
恒温摇床中国科学院武汉科学仪器厂;
CT14RD
台式高速冷冻离心机上海天美生化仪器设
备工程有限公司;
CP-Sil88
色谱柱
(100m×
0.25mm
0.20
μ
m)
Varian
QP-2010
气相色谱
质谱联用
仪日本岛津公司。
1.2CLA
的测定及标准曲线制定
1.2.1GC-MS
检测条件
[7]
气
质联用仪
,升温程序为
70℃
维持
10min
,以
5℃/min
速率
升温至
170℃
,维持
,再以
2℃/min
190℃
1℃/min
速率升温至
210℃
进样口温度为
220℃,检测器温度为220℃;
柱前压为182.2kPa
,柱流
速为
0.8mL/min
氢气流速为
50.0mL/min
,空气流速为
400.0mL/min
分流比为
1:
30
进样量为
1
L
采用电子
电离源
(EI)
,离子阱温度为
250℃
,连接口温度为
220℃,
采用全离子扫描方式,扫描质量(
m
/
z
范围为
100
~
350
1.2.2CLA
标准曲线的制定
吸取
200
的
甲酯标准样品,正己烷定容于
25mL
的容量瓶,配制为
8
L/mL
,分别移取
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6mL
定容至
1mL
,转移至
7
个气相色谱
自动进样瓶中,进行
GC-MS
分析。
并以
的添加量
为横坐标
x,μ
L/mL)
,峰面积为纵坐标
y,
×
10
4
,建
立
气相色谱标准曲线,得出回归方程y
=3.0246
x-
0.0604(
R
=0.9989)
,线性相关范围
4.8
1.3CLA
转化率的测定
1.3.1
诱导产酶与发酵培养
菌株接种于
液体培养基活化
次后,以体积分数
2.5%
的接种量接种乳杆菌
菌株于添加有
1.50
‰亚油
酸的
液体培养基中,诱导菌株产亚油酸异构酶
其转
化
为
[8-10]
37
℃恒温
120r/min
摇床培养
36h
,获得
具有共轭亚油酸异构酶的菌细胞。
再次转接菌株,进行
发酵产
的优化实验。
1.3.2
分离萃取
发酵后的培养液经
4℃
6000r/min
离心
,取
发酵液。
采用正己烷萃取发酵液,静置,收集上面的正
己烷层。
在正己烷溶液中加入无水硫酸钠吸水干燥,于
30℃旋转蒸发,去除有机溶剂,
得脂肪酸提取物收集在
试管中,备用。
1.3.3
脂肪酸甲酯的制备
加入
25
的脂肪酸提取物和
2%H
SO
甲醇溶
液于试管中,在
55℃
条件下进行甲酯化
(10min)
,随后用
正己烷萃取,蒸馏水洗涤
次,静置,取上层待测。
由
标准曲线得
含量,再根据底物
的添加
量计算出
的转化率
每个水平实验
3
次
转化率
/%=×
量/(
添加
1.4
单因素及响应面试验
以
的转化率为响应指标,确定较适的发酵培养
基
(MRS
液体培养基与脱脂乳培养基
,考察乳糖与硫酸
铵添加量比、菌液接种量、培养时间、底物
添加量、
乳化剂吐温
-80
的添加量对
转化率的影响。
1.4.1
发酵培养基的种类对
转化率的影响
液体培养基和脱脂乳培养基都可以作为菌株的
发酵培养基,以乳杆菌
菌株为研究对象,活化
次后
转接于这两种培养基。
亚油酸添加量为
‰,菌液接种
量为
,混匀后于
℃、
24h
然后
正己烷萃取发酵液,测得菌体对
的转化率。
1.4.2
乳糖与硫酸铵的添加量比对
发酵培养基中乳糖和硫酸铵的添加量比分别为
2:
3:
2(
其中乳糖添加量依次分别为
0.18
0.15
0.12
0.10g/100mL)
,亚油酸添加量为
‰,
经
诱导过的菌液接种量为
摇床培
养
以不添加乳糖和硫酸铵的发酵培养基作为参照,
考察
的转化率情况。
※生物工程食品科学2013,Vol.34,No.19215
1.4.3
菌液接种量对
乳糖和硫酸铵的添加量比为
,亚油酸添加量
‰,经
0.5%
1.5%
3.5%
4.5%
的发酵条件下,
摇床
培养
后分别测得
1.4.4
培养时间对
,发酵培养时
间分别为
24
36
48
60h
养。
然后测得
1.4.5
底物亚油酸的添加量对
考察亚油酸添加量分别为0.50
、1.00
、1.50
2.00
、2.50
对
菌体生长的影响。
乳糖和硫酸铵的添加
量比为
,经
1.4.6
底物亚油酸添加量为
‰,其他条件相同的情况
下,考察吐温
的添加量分别为
0.50
1.00
2.00g/L
1.4.7
响应面试验设计
通过
Excel
软件进行单因素方差分析。
在此基础上,
选出具有显著性差异的
个影响因素
接种量、培养时间、
亚油酸添加量
进行响应面试验。
按
Box-Behnken
中心组合
设计原理,确定
个影响因素水平的中心点,取
个水平。
2结果与分析
2.1GC-MS
检测结果
0.0
1.0
1.5
505560657075
a
b
A
/min
V(m
01
75
50
50100150200250300
O
B
m/z
%/
67
81
55
59
41
38
44
95
93
109
123
135
150
164
178
207
220
234
263
281
294
313
A.
气相色谱图;
B.a
峰的质谱图;
C.b
峰的质谱图。
图1气相色谱图与质谱图
Fig.1GC-MSanalysisofCLAsample
由图1可知,
峰和
峰能较好的分离开
(图1A)
,出
峰时间分别为
65.905min
和
66.551min
,与c
甲
酯、t
甲酯的出峰时间相吻合,并具有分子离
子峰m
z为
294(图1B、C)
说明
峰为c
峰为
[11-13]
,乳杆菌
菌株能将
转化为两种具
有生物活性的
异构体c
2.2
5
6
LAC
图2两种培养基对CLA转化率的影响
Fig.2EffectofculturemediaontheconversionefficiencyofCLA
由图
可知,转接经
诱导后的菌株进行发酵培养
转化率要高于直接进行诱导培养的,证实了乳杆
菌株产生亚油酸异构酶转化
,减弱
其生长的抑制作用。
培养基中的
转化率高于脱
脂乳培养基中的
转化率,说明
培养基是转化
的较适宜培养基。
2.3
0:
02:
13:
21:
12:
31:
图3乳糖与硫酸铵的添加量比对CLA转化率的影响
Fig.3Effectoflactose/ammoniumsulfateconcentrationratioonthe
conversionefficiencyofCLA2162013,Vol.34,No.19食品科学※生物工程
可知,乳糖与硫酸铵添加量比对
的影响不显著
P>
0.05)
乳糖作为
菌株产
的碳
源,硫酸铵作为氮源
[14]
,与牛肉膏结合使用,影响菌株
的生长。
当乳糖与硫酸铵的添加量比为
时,
转化
率是最高的,从而选出较适宜产
的乳糖与硫酸铵添
加量比。
2.4
0.51.52.53.54.5
/%
图4菌液接种量对CLA转化率的影响
Fig.4EffectofinoculumamountontheconversionefficiencyofCLA
可知,菌液接种量对
转化率的影响显著
P<
主要是由亚油酸异构酶起作
用,增加接种量可以提高酶量,对产
有利。
而接种
量过大,会影响到菌株生长,再加上培养基中营养成分的
减少,抑制菌株的新陈代谢,导致亚油酸异构酶活性降
低。
故当菌液接种量为
转化率是最高的。
2.5
/h
1224364860
图5培养时间对CLA转化率的影响
Fig.5EffectofculturetimeontheconversionefficiencyofCLA
可知,培养时间对
随着培养时间的增加,
转化率增加,
而当培养时间为
转化率达到最高,继续
延长培养时间,
转化率下降,可能是菌株代谢物
及生长环境
pH
值的改变影响了亚油酸异构酶的酶反应
体系和酶活力。
2.6
可知,亚油酸添加量对
转化率的影响显
著
共轭亚油酸的转化需要亚油酸的诱导,则
直接添加亚油酸比较好
[15]
Dawson
等
[16]
认为,细菌为了
减除
对菌细胞生长的毒害,产生亚油酸异构酶来转化
,但
添加量加大,对亚油酸异构酶有抑制作
用,降低酶活性,使得
转化率下降。
当
‰时,
0.51.01.52.02.5
LA/‰
图6亚油酸添加量对CLA转化率的影响
Fig.6EffectofLAconcentrationontheconversionefficiencyofCLA
2.7
添加量对
0.00.51.01.52.0
-80/(g/L)
图7吐温-80添加量对CLA转化率的影响
Fig.7EffectofTween-80concentrationontheconversionefficiencyofCLA
可知,吐温
转化率的影响不
显著
使用不同种类的乳化剂,可影响
转化率,吐温
作为乳化剂对
转化率影响最大,则选
用了吐温
作为乳化剂
[17]
与未使用吐温
相比,
转
化率有所增大。
故确定吐温
的添加量为
2.0g/L
2.8
响应面试验结果
表1Box-Behnken设计方案及结果
Table1Box-Behnkendesignandresults
试验
号
因素
A接种量
B培养时间
C亚油酸添加量
‰试验值预测值
-
1(2
.
5)
1(36)0(1.25)4.824.77
20(3.0)0(42)06.936.88
31(3.5)0
1(1.00)5.375.42
41
105.044.95
50006.786.88
60006.886.88
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- 响应 优化 杆菌 菌株 共轭 油酸 工艺 研究