斑点叉尾天然单链ScFv噬菌体抗体库的构建及初步鉴定Word下载.docx
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斑点叉尾■;
抗体库;
噬菌体展示;
抗体单链(scfv)
constructionandpreliminaryidentificationofsingle-chainantibolylibraryof
naturalphageinchannelcatfish,ietaluruspunetaus
wanghui1,zoushi-ping2
(1.collegeoffisheries,huazhongagriculturaluniversity,wuhan430070,china;
2.yangtzeriverfisheriesreserchinstitute,chineseacademyoffisherysciences,wuhan430223,china)
abstract:
peripheralbloodlymphocyteswereisolatedfrom250mlblood,whichwasobtainedfrom50non-immunnizedhealthychannelcatfishthroughtheirvenacaudalis.theheavychainfdandlightchaincdnasynthesizedfromthetotalrnaoflymphocyteswerepcramplifiedandtheamplificationproductswerecompactedbylinker—primermixintoscfv.thentheamplificationproductswereligatedsuccessivelyintothephagemidvectorp3mh,thentheligatedsamplewastransformedintocompetente.colixl1-blue.thetransformedcellswereinfectedwithvcsm13helperphagetoyieldrecombinantphagescfvantibody.thesuccessfulconstructionofnaivechannelcatfishphageantibodylibrarycreatedfavourableconditionsforselectingspecificphageantibodyandabstractingspecificantigen.
keywords:
ictaluruspunctatusrafinesque;
antibodylibrary;
bacterialphage;
scfv
斑点叉尾■(ictaluruspunctatusrafinesque)亦称沟鲶(channelcatfish),属于鲶形目(siluriformes)■科(ietaluridae)鱼类。
主要分布于美国中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地区。
斑点叉尾■是水产养殖业中最为重要的养殖鱼种之一,自20世纪80年代引进我国以来养殖规模不断扩大,出口量也在逐年上升。
但是由于斑点叉尾■种质资源退化严重,养殖技术较低,养殖环境恶化等原因,导致人工养殖的斑点叉尾■病害频发,给养殖业带来巨大损失。
斑点叉尾■疾病防治应当坚持“预防为主,防重于治”的原则。
噬菌体抗体是指采用基因克隆技术将b细胞全套可变区基因克隆出来,通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接,以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的抗体分子。
用b淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库[1]。
该技术克服了单克隆抗体杂交瘤细胞中抗体不稳定、容易丢失的弊端,直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体[2-4]。
本实验室采用未经免疫的健康斑点叉尾■外周血单个核细胞(pbmc)为基因来源,建立斑点叉尾■天然单链(scfv)噬菌体抗体库。
构建的主要目的是为后期筛选抗原特异性抗体打下基础,筛选出的抗体主要用于斑点叉尾■疾病早期的抗体诊断试剂盒,从而更有效地对斑点叉尾■疾病进行防治。
1材料与方法
1.1材料
淋巴细胞分离液购自上海超研生物科技有限公司;
rna提取纯化试剂trizol(bioflux)、逆转录试剂盒、taqdna聚合酶、dntp购自takara公司;
t4dna连接酶购自promega公司;
限制性内切酶speⅰ、xhoⅰ、sacⅰ、xbaⅰ、pmd-18tsimplevector载体及试验所用培养基均购自北京盈信阳光生物技术有限公司;
dna凝胶回收试剂盒,质粒纯化试剂盒均购自鼎国生物公司。
宿主菌xl1-blue,由本实验室保存;
辅助噬菌体vcsm13,来自武汉生物制品研究所;
载体p3mh,由海军总医院王琰教授惠赠,由本实验室保存。
引物序列:
p1(vhfor):
5′-cggagctcacaccagtccttt
ggggaaatcgtc-3′
p2(vhback):
5′-gctctagagactggctcttt
ctgaacgtgaccg-3′
p3(vlfor):
5′-cgagctctctgctcttccagga
gaaacagtcac-3′
p4(vlback):
5′-gctctagagacaccaccttg
ttcctccactgac-3′
p5(vhfor-linker-vlback):
5′-tggggcgggaccgtcaccgtcggtggaggcggttcaggcggaggtggcggaggtggctctggctcgattgagctctctcca-3′
1.2试验方法
1)淋巴细胞的提取和纯化。
通过尾静脉从未经免疫的多条斑点叉尾■抽取外周静脉血共250ml,常规方法分离pbmc。
洗涤计数后,每107个细胞加1mltrizol提取总rna,经异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤后溶于1g/ldepc水中,取适量做琼脂糖凝胶电泳,鉴定rna质量,并用紫外分光光度计测定rna浓度,其余保存于-70℃。
2)逆转录cdna和pcr扩增vh段及vl链基因。
以oligodt20为引物,按照takara产品说明书,将rna逆转录为cdna。
分别用轻链vl,重链vh引物(p1、p2、p3、p5)进行pcr扩增。
95℃预变性5min;
94℃30s,64℃(不同引物组合退火温度不同,波动于55~65℃之间)30s,72℃50s,30~35个循环;
72℃延伸10min。
3)以纯化的vh、vl基因为模板,以与vh基因3′端和vl基因5′端序列互补的p5为引物,进行重叠延伸反应,4μl20mmol/l的mgcl2,5μl10×
mmol/ldntp,0.5μlbsa(10mg/ml),2μlcdna,28.5μl去离子水,总体积50μl,反应条件为94℃1min,63℃4min,共7个循环,将vh、vl随机拼接为单链(scfv)。
4)单链(scfv)pcr产物经过电泳,回收,纯化,连接t载体,然后转化xl1-blue,提取质粒后,经sacⅰ和xbaⅰ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。
将表达载体p3mh用同样的两个酶进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带,再与已经回收的轻链片断进行连接反应(pcr产物0.45μg,线性载体1.4μg),4℃连接过夜。
次日加入200μl超级感受态xl1-blue,进行热激转化(冰浴30min,42℃热激90s,冰浴1~2min)。
转化反应结束后立即加入800μg预热到37℃的soc培养基,37℃,200r/min振荡1h。
加入10mlsoc培养基(含50mg/ltet和25mg/lamp)。
取部分菌液铺lb-amp琼脂平板,计算库容。
5)上述菌液加入soc-amp培养液振荡1h后,加入辅助噬菌体vcsm13约1012pfu,混匀后加入50mlsob培养基,继续振荡培养2h,之后加入kana至70mg/l,37℃振荡过夜。
次日4℃,4000r/min离心15min,得到上清液,加入聚乙二醇8000及nacl使两者的终浓度为40g/l和30g/l。
振荡促溶,冰浴30min,9000r/min离心20min,4℃。
弃上清液,用2ml10g/lbsa-pbs悬浮噬菌体沉淀,14000r/min离心5min,除去残留的细菌碎片。
收集上清液,加入nan3至0.2g/l,4℃保存。
至此,用dna重组的方法,将单链基因(scfv)组合到了噬粒载体,即为scfv噬菌体表面呈现文库。
6)将适量ova-smp、ova-smz分别溶解于0.1mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液中,包被无菌elisa板,100μl/孔,置于无菌小湿盒4℃过夜。
次日用pbst洗板3次后用5%bsa-pbs37℃封闭2h,弃封闭液,同上洗涤,干燥备用。
7)取等体积1%ova-pbs与库菌液混合,37℃孵育30min。
取包被孔2孔,加入上述混合液100μl/孔,37℃孵育2h;
同时接种10μl大肠杆菌xl1-blue于10mllb中,37℃220r/min振荡培养至对数生长期。
弃去孔中的液体,用150μl/孔pbst(0.1%tween-20)洗涤,过程中用移液器反复吹打,重复洗涤5次,每次5min。
然后加入100μl孔甘氨酸-盐酸洗脱液(ph2.2),37℃孵育30min,再加入7μl/孔2mol/ltris中和,之后将液体转移到10ml无菌离心管中,加入2ml新鲜制备的大肠杆菌xl1-blue,37℃孵育30min,分别取10μl、1μl、0.1μl涂lb-a-t平板(amp50μl/ml,tet10μl/ml),37℃培养过夜,计数菌落数,测定转化率。
其余菌液全部转入10mllb培养液(tet10μg/ml)中,加入5μlamp,37℃振荡培养1h,再加入5μlamp,继续振荡培养1h,然后再转入100mllb培养液(amp50μg/ml,tet10μg/ml)中继续培养2h,加入约1012pfu辅助噬菌体vcsm13,37℃继续培养2h,再加入卡那霉素终浓度至70μg/ml,37℃180r/min振荡培养过夜。
4℃,4000r/min离心15min,收集上清液,加入4gpeg8000和3gnacl,37℃摇床促溶5min后冰浴30min,4℃8000r/min离心30min,弃上清液,倒置离心管10min沥干残液,加入3ml含1%bsa的tbs重悬沉淀,4
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- 关 键 词:
- 斑点 天然 ScFv 噬菌体 抗体 构建 初步 鉴定