人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32121对SHSY5Y细胞的细胞毒性作用Word格式文档下载.docx

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细胞凋亡相关实验发现，转染细胞AnnexinV/PI双染阳性细胞数量增多，pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低。

结论瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用，并诱导启动细胞凋亡过程。

【关键词】doppel蛋白；

朊蛋白；

细胞毒性作用；

细胞凋亡

ChinaABSTRACT:

ObjectiveToobservethebiologicalactivitiesofhumandoppel（Dpl）proteintransientlyexpressedandDpl-likeproteinPrPΔ32-121onahumanneuroblastomacelllineSH-SY5Y.MethodsRecombinantmammalianexpressionplasmidscontaininghumanPRNDgeneandtruncatedPrPΔ32-121fragmentweregeneratedbyPCR.TheexpressionandlocationofDplandPrPΔ32-121post-transfectionwereobservedbyIFA.ThecytotoxicitywasmeasuredbyMTTanalysis.CellularapoptosiswasinvestigatedbyflowcytometryandWesternblot.ResultsBothDplandPrPΔ32-121proteinwereexpressedandmainlylocatedonthecellmembrane.RemarkablecytotoxicitywasdetectedonSH-SY5Ycellsafter24htransfection.Meanwhile,moreAnnexinV/PIpositively-stainedcellsaswellaslowerlevelsofcellularpro-caspase-3andBel-2weredetectedinthecellsreceivingDplandPrPΔ32-121expressingplasmids.ConclusionDplproteintransientlyexpressedandPrPΔ32-121canleadtothesimilarneuralcytotoxicity,probablytriggeringthecellapoptosisprogram.

　　KEYWORDS:

doppelprotein;

PrP;

cytotoxicity;

apoptosis

朊病毒病（priondisease）是一类累及人类及多种动物中枢神经系统的致死性退行性疾病，潜伏期长，致死率高达100%，包括人类的克雅氏病（Creutzfeldt-Jakobdisease,CJD）、牛的疯牛病（bovinespongiformencephalopathy,BSE）等[1]。

其致病因子目前认为是由细胞内正常朊蛋白PrP（或称PrPC）经空间构象转变后形成的异常折叠朊蛋白PrPSc所致[2-4]，但对PrPC正常功能及PrPSc致病机制的研究仍不甚明了。

近年来随着PRND基因的确立[5]，发现其编码一种朊蛋白样的膜蛋白，称作doppel（Dpl）蛋白，它和PrPC序列高度同源，两者的C末端具有25%同源性，但正常情况下在睾丸和心脏中高表达，而在脑中几乎不表达[5-6]。

为了研究Dpl的生物学功能及其在朊病毒病发病机制中的作用，本实验在前期工作的基础上[7]，构建了人源Dpl及其结构类似蛋白N端截短型PrP（PrPΔ32-121）真核表达质粒，在体外瞬时表达后，探讨Dpl蛋白和PrPΔ32-121蛋白对SH-SY5Y细胞的影响。

　　1材料与方法

　　1.1主要试剂

　　质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司；

细胞培养液DMEM购自美国Gibco公司；

LipotectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；

PrP特异性单克隆抗体3F4购自丹麦Deko公司；

6G3、β-actin和Bcl-2单克隆抗体及Dpl、Bax和casepase-3多克隆抗体均购自美国SantaCruz公司；

ECLKit购自美国Perkin-Elmer公司；

四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；

AnnexinV/PI双染试剂盒购自上海宝赛生物公司。

　　1.2真核表达质粒的构建

　　人全长PrP基因表达质粒pcDNA3.1-huPrP1-253及全长Dpl基因表达质粒pcDNA3.1-huDpl1-176由本室保存。

pcDNA3.1-huPrPΔ32-121的PCR扩增：

根据人PRNP基因序列设计引物，上游引入BamHⅠ，下游引入EcoRⅠ酶切位点（上游5′-GCGGATCCATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATG-3′，下游5′-GCGAATTCTCAT-

CCCACTATCAGGAAGATGA-3′）；

另外一对中间引物（上游5′-CAGCATGTAGCCGCCAAGGCCCCCGTTCCATCCTCCAGGCTTCGGGCG-3′，下游5′-CGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACGGG-

GGCCTTGGCGGCTACATGCTG-3′）。

PCR反应条件：

94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30个循环。

PCR产物回收后与载体pMD18-T连接，经酶切后回收产物连接至pcDNA3.1（zeo+）真核表达载体，酶切及测序鉴定序列正确。

　　1.3细胞培养及转染

　　SH-SY5Y细胞培养液为含4.5g/L谷氨酸和100mL/L胎牛血清的DMEM。

细胞用6孔板/96孔板培养至对数期生长期，每孔转染的总DNA量分别为2μg/0.2μg，转染使用LipofectamineTM2000转染试剂盒。

　　1.4Westernblot

　　瞬时转染SH-SY5Y细胞24、48h后收获6孔板细胞，刮下的细胞用PBS洗涤2次，5000r/min离心5min；

在细胞裂解缓冲液（5mL/LTritonX-100，5g/L去氧胆酸钠等）中4℃孵育30min。

样品煮沸10min后进行150g/LSDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，一抗用含有50g/L脱脂奶粉的PBST（1∶600）稀释，4℃过夜；

二抗用同上的PBST（1∶4000）稀释，最后用ECL显色试剂盒显色。

　　1.5间接免疫荧光（IFA）

　　转染后24h的细胞爬片用40g/L多聚甲醛溶液固定，室温15min，2mL/LTriton-X100通透5min，含100mL/L胎牛血清的PBST封闭45min，加一抗37℃孵育2h，二抗（FITC标记）室温孵育1h，复染后显微镜下观察。

　　1.6MTT检测

　　瞬时转染24、48h的96孔板细胞，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，继续培养4h，吸去培养液；

加入200μLDMSO，摇床震荡10min，使结晶物充分溶解；

450nm处用酶标仪测吸光度（A）值。

实验重复3次，取其平均值。

细胞存活率=实验组A值/对照组A值×

100%。

　　1.7流式细胞仪检测

　　瞬时转染24/48h的6孔板细胞，胰酶消化后用PBST洗涤2次，加入AnnexinV和PI染料室温避光孵育15min，流式细胞仪上机检测。

具体参见上海宝赛生物公司AnnexinV/PI双染试剂盒说明书。

　　1.8统计学处理

　　Westernblot图像定量分析使用TotalTech图像处理软件（Pharmacia，美国）。

数据以条形图表示，采用t检验进行统计学分析。

每组数据的平均数均为进行3次独立实验的结果，并以平均数±

标准差表示。

以空质粒pcDNA3.1组作为对照组进行统计分析。

P&

lt;

0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1Dpl及PrPs蛋白表达的鉴定

　　质粒pcDNA3.1-huPrP1-253、pcDNA3.1-huPrPΔ32-121和pcDNA3.1-huDpl1-176瞬时转染SH-SY5Y细胞24h后，收获细胞进行间接免疫荧光检测。

结果可见，实验组的细胞膜上均出现了明显的绿色荧光，提示各重组表达质粒均在细胞中表达外源蛋白（图1）。

　　2.2Dpl及PrPΔ32-121可诱导明显的细胞毒性效应

　　为检测瞬时转染SH-SY5Y细胞后表达的Dpl及PrPΔ32-121蛋白对细胞生长的影响，我们分别在转染了24、48h后进行MTT实验。

结果发现，无论转染后24h还是48h，Dpl和PrPΔ32-121组较对照组（空载体及PrP1-253组）均出现了明显的细胞生存率下降现象，差异有统计学意义（P&

0.05，图2）。

　　2.3Dpl及PrPΔ32-121表达后凋亡相关蛋白的表达情况

　　为了观察Dpl及PrPΔ32-121蛋白表达后凋亡相关因子Bcl-2、Bax及caspase-3水平的变化情况，我们将重组质粒pcDNA3.1-huPrP1-253、pcDNA3.1-huPrPΔ32-121和pcDNA3.1-huDpl1-176瞬时转染SH-SY5Y细胞48h后，提取细胞蛋白，进行Bcl-2、Bax及caspase-3（即全长无活性的pro-caspase-3）的Westernblot检测。

条带经凝胶灰度扫描软件分析后发现，与空载体对照组相比，Dpl及PrPΔ32-121实验组凋亡促进因子Bax蛋白的水平几乎没有变化，而凋亡抑制因子Bcl-2的水平出现了显著的下降（P&

0.01，图3），caspase家族的pro-caspase-3蛋白由于被切割激活而显著降低（P&

0.05，图3）；

而PrP1-253组则与空载体组几乎一致。

　　2.4细胞凋亡情况

　　为进一步确证Dpl及PrPΔ32-121诱导细胞凋亡的效应，我们在pcDNA3.1-huPrP1-253、pcDNA3.1-huPrPΔ32-121和pcDNA3.1-huDpl1-176质粒转染SH-SY5Y细胞48h后，采用Annexin-V/PI双染流式细胞技术检测细胞凋亡情况。

双染结果显示，Annexin-V/PI双染阳性细胞数在转染了pcDNA3.1、pcDNA3.1-huPrP1-253组中大致相同，无明显差异；

而Dpl组（P&

0.01）及PrPΔ32-121组（P&

0.05）与对照组（pcDNA3.1组）相比，双染阳性细胞率均有明显的提高，并呈现统计学差异（图4）。

　　3讨论

作为一种朊