凝胶过滤层析技术原理讲解Word格式文档下载.docx

凝胶过滤层析技术原理讲解Word格式文档下载.docx

《凝胶过滤层析技术原理讲解Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝胶过滤层析技术原理讲解Word格式文档下载.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;

较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;

基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。

注1:

球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。

（2）应用范围

A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;

B分子量测定，蛋白质分子量（球形）的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系;

C样品脱盐或溶剂置换。

（3）填料要求

一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。

凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

（4）凝胶过滤常用填料种类

目前常用的凝胶包括3个主要类型:

A:

葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名称是Sephadex

Polydextran几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。

SephadexG-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。

以SephadexG-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5ml。

Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下:

型号

粒度（微米）

有效分离范围（球形蛋白质）

G10

55,166

<

700

G15

60-180

1500

G25

-

1000-5000

G50

1500-30000

G75

3000-80000

G100

4000-150000

G150

5000-300000G200

5000-600000

Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。

有效分离范围（球形蛋白质）Superdex3024-44

10000

Superdex7524-44

3000-70000

Superdex20010000-600000

B聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-GelP，干粉颗粒状。

依胶的分离范围不同，分成

Bio-GelP-2至Bio-GelP-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。

Polyacrylamide的化

学性质不活泼，但它在极端的pH下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此

pH值应尽量控制在2-10之间。

有效分离范围（球形蛋白质）Bio-GelP-2-

1800

Bio-GelP-4-

800-4000

Bio-GelP-6-

1000-6000

Bio-GelP-10-

1500-20000

Bio-GelP-30-

2500-40000

Bio-GelP-60-

3000-60000

C琼脂糖凝胶

商品名称Sepharose，由属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose2B，4B和

6B。

Agarosegel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因

其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需

于较低温的环境中进行层析。

Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

经2，3,二溴丙醇反应交联而成的凝胶为SepharoseCL型凝胶

有效分离范围（球形蛋白质）Sepharose2B70000,40000000

Sepharose4B60000,20000000

Sepharose6B

400000010000,

SepharoseCL-2B70000,40000000

SepharoseCL-4B60000,20000000

SepharoseCL-6B

10000,4000000

Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。

有效分离范围（球形蛋白质）Superose6

5000,5000000

Superose12

1000,300000

其它凝胶:

聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶，交联聚苯乙烯凝胶，聚乙烯醇凝胶等，还有更多新型号的凝胶。

4操作实例（转载）

1）凝胶溶胀

凝胶颗粒要求大小比较均匀

，可流速稳定，结果较好。

取葡聚糖SephardexG-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。

溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。

待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。

2）装柱与平衡

装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。

关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。

装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。

将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。

通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。

3）上样与洗脱

样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。

上样时应尽量保持床面的稳定。

先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1,2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。

按加样操作，用少量（约1ml）洗脱液冲洗管壁2次。

最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3,5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。

上样的体积，分析用量为柱床容积的1-2%;

制备用量为柱床容积的20%~30%。

4）收集与鉴定

用自动部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。

5）凝胶柱的处理

凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。

短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。

建议长期用干燥状态保存。

计算

分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。

只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数（logMr）对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。

注意事项

各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。

操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。

始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。

蛋白质凝胶过滤层析动画,原创版

该动画由生化工程国家重点实验室和国家生化工程技术研究中心（北京）提供，引用请注明出处:

凝胶渗透色谱（GPC/SEC）技术

一、凝胶渗透色谱的概述

1.凝胶渗透色谱的简单回顾

凝胶渗透色谱[GPC（GelPermeationChromatography）][也称作体积排斥色谱（SizeExclusionChromatography）]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。

利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。

McBain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。

1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。

而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。

二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高

灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了

液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。

凝胶渗透色谱的应用2.

三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。

尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现（目前其理论塔板数已超过10000/米）以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。

特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。

例如:

常见的聚苯乙烯塑料制品，其分