浅谈诺贝尔化学奖超高分辨率荧光显微成像_精品文档资料下载.pdf
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其主要贡献者也成为2014年诺贝尔化学奖的获得者。
本文简要讲述超分辨显微技术的发展历程并对其发展趋势进行展望。
关键词光学衍射极限超分辨荧光成像受激发射损耗随机显微重构单分子成像中图分类号061:
G64NobelPrizeinCheIIlistry2014:
Super-resolvedFluorescenceMicroscopy+SunYujieChenXuanze0stmeKey毛以bor8哪可8io眦舶meo以Me舶ro凇B洒汹10k酎,B洒d舯眺opt泌ntlmn咖gCemerOPlCl。
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据w邵,n硒曙泌倦iy,讲ng100871,吼i胁)AbstractSuperres01utionmicroscopyisprobablyoneofthefastestdevelopedandmosteyecatchingnewopticaIimagingtechniquesduringthepastfbwyearsThesegroupoftechniquesbreaktheopticaldifhactionlimitsandincreasethespatialres01utionfromsevemlhundrednanometerstotensofnanometers,pmvidingapowerfultoolforlifesciencesThemainstreamsupe卜resolutiontechniquesarebasedeitheronpointspreadfunctionen舀neeringorsinglemoleculelocalizationThemajorcontributorswereawardedbythe2014NobelChemistryprizeThisreviewpmvidesabriefhistoryofthedevelopmentofsuperresolu“ontechniquesandtheirworkingmechanismsAnout100kisalsopmposedforthefutureofsuperresolutionimagingKeyWOrds0p“caldiffhctionlimit;
Supe卜resolutionnuorescenceimaging;
Stimulatedemissiondepletion(STED);
Stochasticreconstruc“onmicmscopy;
Singlemoleculeimaging1光学显微成像的衍射极限生物医学成像技术是基础生物学研究和临床医学最重要的工具之一。
回顾历史,已有多位科学家凭借在成像技术方面的突破获得诺贝尔奖。
其中,Roentgen因发现x射线获得1901年诺贝尔物理学奖:
zemike因发明相衬显微镜获得1953年诺贝尔物理学奖;
Ruska的电子显微镜以及Binning和Rohrer的扫描隧道显微镜获得1986年诺贝尔物理学奖;
Lauterbur和Mansfield因发明核磁共振成像技术共同+基金资助:
国家青年千人计划;
基金委重大仪器设备研发专项(No31327901)通讯联系人,Email:
sunyujiepkueducn蓬万方数据2大学化学第30卷获得2003年诺贝尔生理医学奖。
在刚刚过去的2014年,诺贝尔奖评审委员会再一次肯定成像技术的重要性将诺贝尔化学奖授予发展超分辨率荧光显微成像技术的3位科学家。
他们分别是来自美国霍华德休斯医学研究所的EricBetzig、德国马普生物物理化学所的stefanwHell和美国斯坦福大学的WilliamEMoemer(图1)。
图l获得2014年诺贝尔化学奖的3位科学家光学显微成像的起源大约可以追溯到16世纪末荷兰眼镜商Janssen和他的儿子发明的原始光学显微镜。
他们把两个凸透镜安装在一个筒中,发现这种组合可以放大物体。
在之后的几十年中,荷兰人AnthonvvonLeeuwenhoek和英国人RobertHooke在成像原理和实践中不断改进,实现了现代光学显微镜的雏形。
Leeuwenhoek第一次观察到了牙缝中的细菌:
而Hooke则于1665年在显微镜下看到了软木塞的微小结构并将其命名为细胞(cell),成为生物学研究的一个里程碑。
在接下来的300多年里,各种基于光学显微的生物成像技术不断涌现,生物学家也因此取得了一个接一个重大发现。
虽然光学显微镜如此有用,但生物学家一直不满意其分辨率。
特别是细胞生物学家在观察细胞内部结构时图像模糊,无法看清楚细节。
在实际操作中,有多种因素会影响光学成像的清晰度,包括样品自身的背景光以及对光的吸收、散射和折射等光与物质的相互作用过程,也包括物镜的色差、球差、透光度和成像元件的灵敏度等硬件因素。
在这些因素之外,光学成像的分辨率的理论极限则是由光的衍射决定的。
早在1835年,英国科学家GeorgeBAiry就提出了“爱里斑(Airydisk)”的概念(图2):
由于光的衍射,即使一个无限小的发光点在通过透镜成像时都会形成一个弥散的图案,即爱里斑,而其在像平面处的光强分布函数称为这个光学系统的点扩散函数(pointspreadfunction,PSF)。
图2GeorgeBAiry和他提出的爱里斑万方数据第l期孙育杰等:
浅谈2014年诺贝尔化学奖:
超高分辨率荧光显微成像31873年,德国著名科学家EmstAbbe揭示了由于光学成像有限孔径下光的衍射效应产生的Airydisk与成像分辨率之间的关系,即著名的阿贝光学衍射极限理论(Abbesdiffractionlimit)。
d=志
(1)式中d是分辨率,A是光的波长,n是介质的折射率,p是聚焦光锥的半角。
nsin臼又称为数值孑L径(numericalaperture,NA)。
基于这个公式可以看出,对于可见光波段(波长400700nm)以水为介质的成像,由于水的折射率为133,而sinp最大值是1,则其分辨率极限约为150nm。
当然,p角无法达到90度,而实际上水镜的数值孔径(NA)一般在1左右。
所以通常可以定义成像分辨率约为光的波长的一半,即当两个点光源相距200nm以内时,它们的A岫disk会有很大的重叠而无法区分;
同时这个公式也限定了光束聚焦形成光斑的最小尺寸约为光波长的一半。
阿贝光学衍射极限理论给了我们基本的物理极限,意义重大,因此Abbe的这个经典公式也成为了他墓碑上的全部内容(图3)。
图3EmstAbbe揭示了光学成像中著名的阿贝光学衍射极限理论(Abbesdi圩ractionliInit)。
其经典公式成为他墓碑上的全部内容关于阿贝光学衍射极限还有两点值得一提。
一是该衍射极限对分辨率的限制也适用于其他基于物质波成像的技术,从x射线到超声成像。
像x射线和电子显微镜的成像波长远远小于可见光的波长,因此有非常高的空间分辨率。
但可惜这两个技术目前在活体成像方面还有很多困难,另外也不容易像荧光显微镜一样对目的分子实现特异成像和观察。
另外一点是这个200nm的分辨率极限正好对生物学研究有很大的制约。
首先,很多亚细胞结构和细胞器的尺度都是几百纳米到几微米,而最常用的模式生物之一大肠杆菌也就是2微米长、05微米粗。
在这些情况下,200nm的分辨率极限制约了我们对于细节的观察。
另外,细胞本身是高度拥挤的,即使目的分子的细胞内浓度只有1斗moLL,在光学衍射极限的200nm见方的立方体中也有5个目的分子,而衍射极限的存在却使我们无从知道这个体积内的具体分子数目,也无法区分它们。
因此,生物学研究迫切地需要“突破”衍射极限的超高分辨率显微成像技术。
2“突破”光学显微成像的衍射极限实际上,衍射极限是一种远场(far一6eld)效应,在近场(nea卜6eld)条件下无效。
因此早期的一些尝试突破光学衍射极限的努力都是基于近场光学成像的。
像这次诺贝尔奖得主EricBetzig就早在1993年发展了扫描近场光学显微镜,首次实现了室温下的单分子超分辨率成像2|。
然而,近场光学显微镜无法用于细胞内部的成像,因此在生物领域的应用一直没有发展起来。
后期的各种“突破”光学衍射极限的努力都是在远场条件下发展起来的。
万方数据4大学化学第30卷超高分辨率显微成像一般指在远场条件下基于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技术。
荧光是物质吸收光照后发出的一类
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